Уважаемые коллеги. В нашу лабораторию поступила среда для долговременного культивирования гемопоэтических клеток MyeloCult от Stemcelltechnoilogies. До этого мне с ней работать не приходилось, поэтому возникло несколько вопросов. Если кто-нибудь уже работал с данной средой, помогите пожалуйста чайнику

Вопросы:
1)Так ли уж необходимо покрывать коллагеном поверхность чашек (в моем случае плейтов), на которых будут расти клетки? Ведь клетки фидера (фибробласты человека) вполне сносно садятся на адгезивный пластик (BD Falcon).

2)А в случае, если покрытие так важно для культивирования, можно ли использовать вместо коллагена желатин?

3)Как ингибировать пролиферацию клеток фидера?
В соответствии с мануалом к среде клетки фидера перед посадкой тестируемых клеток необходимо облучить определенной дозой радиации, дабы ингибировать их пролиферацию, но при этом не убить. Проблема в отсутствии у нас источника ионизирующего излучения, что заставляет искать альтернативный способ ингибирования пролиферации клеток фидера.

4)Какие посадочные концентрации клеток в тестируемой суспензии стоит использовать?
Вопрос не совсем корректен, но все же...хотя бы приблизительно, чтоб зря среду не тратить.
(Источник клеток: кордовая кровь, выделение в ГЭК)

1. В инструкции к MyeloCult питающие клетки M2-10B4 не синтезируют подложку. Фибробласты сами синтезируют подложку. Коллаген и желатин им не нужен.
3. Проще найти источник. Впрочем, у фибробластом есть контактное торможение. Теоритически монослой не пролиферирует.
4. 5 x 105 говорит инструкция.

2 Vadim Sharov
Спасибо.
Вам лично не приходилось иметь дело с MyeloCult?

Инструкция эта у меня есть. Просто дела обстоят так, что приходится "оптимизировать" их методику к нашим грустным реалиям.

1. Решили попробовать для первого раза прокультивировать и с коллагеном, и без него - сравнить, так сказать, "прилипательно-распластывательную" способность.

3.С источником никак - изотопка при институте приказала долго жить, а везти фласки с клетками через весь город - та еще авантюра. Решили ингибировать пролиферацию добавлением антибиотика, но при этом возникает проблема как потом отмыть клетки от антибиотика, чтобы не было ингибирующего воздействия на исследуемые клетки. Кроме того, есть планы отдать часть клеток после культивирования на FACS, но если там будет антибиотик, то аутофлуоресценция последнего лишает цитометрию всякого смысла - уже пробовали.
Остается надеяться, что после стольких замен среды и большой продолжительности культивирования, концентрация антибиотика будет исчезающе малой, и FACS его не заметит.

В общем, придется идти методом проб и ошибок с набиванием шишек.

1. Вы же тип клеток фидерного слоя сменили. И разница будет не в среде, а в паттерне синтезируемых клетками белков. По большому счету разница между специализированными средами небольшая (лишь в названии, торговой марке и агрессивности рекламной компании), а вот меняя тип клеток Вы переходите в область "много чего не так".
Повторяю, фибробласты человека, в отличии от стандартных M2-10B4, подложку образуют.

3. Антибиотик может быть просто обратим, когда отмоете. Какой, кстати, антибиотик Вы используете? Странно называть фирму производителя пластика и не называть антибиотик.
У меня клетки 15 часов бултыхались: Нью-Йорк - Москва - Пущино. Не бойтесь. В любом случае антибиотик хуже.