Клетки J774 были привезены из Петербурга из ИЦ РАН.
Никак не получается их активировать (хочу, чтобы они начали вырабатывать NO).
Активировал с помощью
1). LPS (E. coli serotype 055:B5 [Sigma]): 0,01; 0,1; 1; 2; 5; 10; 50; 100 мкг/мл
2). IFN-gamma (Sigma): 1000 Е/мл
3). Соместно LPS+IFN-gamma: 10 мкг/мл+100 Е/мл; 50 мкг/мл+100 Е/мл; 100 мкг/мл+100 Е/мл
Клетки инкубировал с соединениями 24 часа. Количество клеток - 10⁵ кл/лунка при использовании 96-луночного планшета (в 100 мкл среды). Использовал среду DMEM без антибиотиков и сыворотки.
Количество NO, а точнее нитрита, определял с помощью реакции Грисса (использовал кит Griess Reagent System компании "Promega"). Максимальный результат, который я получил ~ 11 мкМ нитрита (LPS 50 мкг/мл), хотя в статьях значения значительно выше.
С чем это может быть связано?
У нас возникают небольшие проблемы со снятием клеток - трипсин не сильно помогает, приходится пользоваться скребком (часть клеток погибает, естественно, но монослой в дальнейшем образуется). Может быть это так пагубно влияет на клетки?
Помогите, люди добрые!

По поводу трипсина: что-то странное. Они и без трипсина слетают.
Как делаете пересев?

Что касается проблем с активацией. Может быть пластик сменить? Чего клетки этой линии так прилипают к нему.

Среда DMEM. Добавляли ли заменимые аминокислоты и глутамин?

Линия J774 старая. Не секрет, что линии в разных лабораториях разные. Может в статьях использовали другие субклоны.

Спасибо, Вадим!
Пересев делаем следующим образом: убираем среду, промываем 2-3 раза PBS (~ 1 мл на корель), заливаем трипсин (200 мкл на корель) и инкубируем 2 минуты при +37^о С, далее заливаем среду ДМЕМ с сывороткой и пытаемся смыть клетки. К сожалению никак не хотят слазить нормально, основная часть остается прикрепленной ко дну. Пытались увеличивать время инкубации с трипсином, никаких результатов положительных это не дало.

Пластик сменить попробуем, спасибо

Заменимые АК и глутамин не добавляли. Думаете не хватает их клеткам?

Не знаете ли чем отличаются линии J774, J774.1, J774.2? действительно, большинство работ сделано на линиях J774.1 и J774.2, но и J774 тоже иногда используют, причем у них все прекрасно получается...

http://www.molbiol.ru/protocol/19_01.html
1.слить старую среду;
2.2-3 раза промыть клетки HBSS (без Ca2+, Mg2+) или раствором Версена (~3ml на 25 см2);
3.залить монослой раствором для снятия клеток (чтобы полностью покрывал: ~1ml на 25 см2; но можно и больше, если не жалко); версен-трипсин
4.инкубировать при 370С, периодически аккуратно покачивая. Обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10' (время зависит от клеточной линии);
5.когда клетки полностью отделятся от субстрата, добавить полной среды с сывороткой
Синим мои добавки.

Версеном (ЭДТА) вы удаляете кальций, который является кофактором якорных белков (белков адгезии). С кальцием эти белки слабо доступны трипсину. Тем более 2х минутному. Реально, J774 одним версеном снимаются.

Если Вы пользуете DMEM из пакетов, разводите и фильтруете, заменимые АК, пируват и глутамин там есть. Если закупаете готовую, жидкую, то заменимые АК, глутамин и пируват стоит добавить.
И главное, глутамин и заменимые АК необходимы для синтеза NO, а пируват не помешает для энергетики синтеза. Надеюсь DMEM с высокой глюкозой (4,5)?

Спасибо, Вадим!
DMEM используем со средней концентрацией глюкозы (~3%) и без пирувата (из пакетов, заменимые АК и глутамин есть). Сегодня посадил клетки в DMEM с пируватом, посмотрим, что получится.
Спасибо за совет с версеном, будем внедрять!:)