Здравствуйте)

Я только осваиваю методы работы с культурами клеток. Подскажите, пожалуйста, как решить такую задачу: необходимо заготовить кондиционированную среду после культивирования клеток в течение 48ч для разных задач (элайза, w-блот. tube- assay) Заведомо можно предположить, что концентрация белков в среде м.б. низкой, а спектр интересующих нас белков большой. В лаборатории единого мнения нет. Как лучше:

1) собрать среду, добавить ингибиторы протеиназ, открутить, заморозить
2) просто собрать среду и заморозить
3) концентрировать среду, добавить ингибиторы протеиназ, заморозить
4)концентрировать среду, не добавлять ингибиторы, заморозить
5) Ваш вариант?
Спасибо за помощь

Я что-то не понял, Вас интересуют белки, выделяемые клетками в среду? Обычно кондиционированную среду применяют только для ведения клеток. Если Вы секретируемые белки изучаете, то это не культуральная задача, а биохимическая. Для вестерна и др. денатурирующих методов пойдет любой метод, хотя концентрирование предпочтительнее сделать до замораживания. Для изучения биологической активности замораживать вообще нежелательно, надо работать со свежим материалом.

Спасибо за ответ. Нужна среда для Элайзы, чтобы измерить концентрацию нескольких ангиогенных факторов (VEGF и т.д), был вопрос - надо ли среду концентрировать перед этим. А может ли после концентрирования среды белок, которого в среде много, "мешать" определению концентрации тех белков, которых в среде очень мало???
А может для Элайзы концентрирования вообще не требуется,тк метод обладает высокой чувствительностью. В каких случаях Вы концентрируете среду?
Насколько я поняла, для Tube-forming Assay in vitro лучше использовать среду, не подвергавшуюся заморозке?
Так много вопросов, тк я по образованию медик, в настоящее время только осваиваю теорию и практику биохимических методов. Спасибо за помощь)

Да, концентрирование - палка о двух концах, и если чувствительности Элайзы хватает для определения в неконцентрированной среде, то концентрировать лучше не надо. Но Вы должны поставить первую серию экспериментов или найти протокол в литературе/у коллег, чтобы определить, надо концентрировать или нет.

Что такое Tube-forming Assay, я не знаю. Если это определение биологической активности, то в общем случае замораживание нежелательно, т.к. при этом активность понижается, особенно, если допустить несколько циклов замораживания-оттаивания. Мелкие белки часто выдерживают один-два цикла без существенного понижения активности, но и в этом случае рекомендуют замораживать их в аликвотах, чтобы избегать повторного замораживания.

Спасибо за ответ. Tube forming assay in vitro мы планируем использовать для определения ангиогенного потенциала МСК и тех факторов, которые они выделяют в среду. Т.е. способность формировать трубочкоподобные структуры в матригеле in vitro под действием ангиогенных фактров. Но если одна заморозка - разморозка не повлияет на "жизнеспособность" белков, то лучше, наверное, сделать аликвоты. А мелкие белки - какой порядок Mr ??

Не повлияет - это сильно сказано. Может и повлиять, но неизвестно, сможете ли Вы это обнаружить, т.е. зависит от чувствительности метода. Да, конечно, в аликвотах. Тут дело не столько в размерах белка, сколько в его структуре. Есть белки, которые денатурируют обратимо (РНКаза, например), но таких мало. Чем больше белок, тем выше вероятность его необратимой денатурации. Все известные мне белки, способные денатурировать обратимо, меньше 20 кДа. Полипептиды меньше 10 кДа практически не подвержены денатурации, т.к. не имеют сколько-нибудь сложной пространственной структуры.

Спасибо большое за информацию