Проведение Western blotting. Компоненты ECL кита. Сухой перенос на трансблоттере. Окрашивание белков на фильтре. Характеристики белковых красителей. Гибридизация. Проявление Westerna (ECL-kit). Хранение фильтра после проявления. Отшпаривание от а/т для повторной гибридизации. Хранение а/т.

Глубокоуважаемые администраторы сайта молбиол!

Я получил новые вопросы по вестерну. Возможно, они пригодятся кому-то еще. Вопросы были следующего содержания:
1. сколько и где хранить (+4 или -20) стоковый раствор люминола?
2. где и сколько можно хранить стоковый раствор кумаровой кислоты.


Ответы примерно следующие:
1. Для растворения люминола (который "Раствор B") колба ставится на магнитную мешалку с небольшим подогревом на несколько десятков минут (люминол очень плохо растворяется). Во избежание яркого света колбу рекомендуется накрыть чем-нибудь. Однажды мы забыли колбу на 3 часа и нагрелась она градусов до 60-70, но ничего, работал отлично.
2. Раствор люминола разливается по 14 мл в пластиковые 15-мл пробирки.
2. Раствор кумаровой кислоты (который "Раствор A") разливается по 150 мкл в эппендорфы (для реакции нужно 140 мкл, но разливать в эппендорфы нужно с запасом по причине определенной неточности пипеток).
3. Оба раствора хранятся при -20. Обычно готовится сразу месячный запас люминола (например, на 10 вестернов - 140 мл) и соответствующее количество кумаровой
кислоты, разливается, замораживается и используется пока не кончится. 2-3 месяца с ними ничего не случится (проверено на практике).
4. Растворы размораживаются непосредственно перед
употреблением в водяной бане с теплой водой, а 150 мкл кумаровой кислоты в эппендорфе можно разморозить просто в руке за 2-3 минуты.
5. Необходимо убедиться в свежести перекиси, которую планируется использовать. Мы просто попросили в ближайшей аптеке и нам налили свежайшего раствора.
6. Сама процедура выполняется примерно так: размораживаем 1 пробирку люминола, прямо в нее добавляем 140 мкл кумаровой кислоты, прямо туда же добавляем 5 мкл перекиси, закрываем пробирку, перемешиваем, открываем пробирку, выливаем на наш хайбонд, инкубируем 1 мин, можно прикладывать пленку.

С уважением,

Алексей Терентьев (alexei@icp.ac.ru)

PS. Никак не пойму, как тут отправляются сообщения, прошу меня извинить, если эти сообщения придут несколько раз.

можно ли для буфера для переноса использовать вместо метанола этанол?

Нет проблем пользуйте сам пользовал...

Маленький дополнений к прописи люминола и кумаровой кислоты....
Имхо все это шаманство люмином на мешалка 3 часа пару раз побултыхал и порядок да банку согласен надо фольгой завернуть .... да храним на +4 правда нам политры хватает максимум на месяц....
А кумаровую кислоту вообще при комнатной храним месяцами и никаких проблем не было....
Да и последнее перекись прямо в люминол льем.....

кстати, по-поводу переки, прикольно хранить ее
довольно глубоко в холоде... (т.к. она разлагается
на воду, которая вымерзает....) так, что у вас будет все
время одинаковое ее количество...

http://www.molbiol.ru/forums/style_images/1/p_thanks.gif Tom1

остро, по заграничному! (с)
Том1 ты чеж это не залогинился? смотри, превратишься в Гобочку....

"....смотри, превратишься в Гобочку..."
Типун тебе на язык это был не я.....
Видать ППГ и за меня решил взяться....
Да ждет меня судьба Урри.... а у меня даже маски нет......

Глубокоуважаемые модераторы, у наших коллег возникают разные вопросы. Возможно, приведенная ниже переписка будет полезна кому-то еще. Прилагаю ее без редактирования, как есть.

С уважением,

Алексей.

Привет, Ирина.

Извините, что ответил не сразу. Мой адрес попал в базу данных спамовцев, и я борюсь со спамом каждый день не на жизнь, а на смерть. Из сотни сообщений одно-два смысловых, остальное - мусор. Вот, дошел и до Вашего письма....

Сразу по пунктам.
1. Лизирующий буфер: выбор зависит от свойств белка и его внутриклеточной локализации. Для мембранных - один буфер, для ядерных - другой и т.д. и т.п. Ничего нового я, конечно, не скзал, но, наверное, лучший способ - посмотреть, какие буферы используют Ваши коллеги на том же или похожем белке (по статьям).
Не будет ничего удивительного, если какой-то белок, например, ядерного матрикса просто не войдет в гель по причине того, что не растворился. К слову, один из распространенных способов лизиса - буфер Лэмли. Правда, после растворения ткани в нем нужно будет позаботиться о разрушении ДНК (ультразвук, шприц с тонкой иглой), иначе на гель такую кашицу не нанести. У меня есть несколько рецептов лизирующих буферов. Если Вы не найдете в пабмеде ничего, я их вышлю (правда, никакой экзотики в них нет, к тому же хорошо было бы знать хотя бы какие-то свойства Вашего белка, чтобы быть более конкретным).

2. Фракционирование, наверное, будет дешевле, чем иммунопреципитация. Ничего не поделаешь - это наша работа. Если надо фракционировать - будем фракционировать (или иммунопреципитировать)... Фотошоп - только если Вы уверены в том, что нарисованное Вами соответствует действительности (хотя даже эта уверенность бывает обманчива, посему, если Вам дорого Ваше будущее, хочу Вас от этого отговорить). Нормальные рецензенты имеют те же проблемы, что и Вы, поэтому фраза типа "неидентифицированные полосы" им понятна. От ненормальных рецензентов никто из нас не застрахован (smile).

3. Преабсорбция... Честно признаться, не совсем понял проблему и цель забивки антител.
Лишние полосы - ВНИМАНИЕ!!! НЕ ПРОХОДИТЕ МИМО ОТКРЫТИЙ!!!
Если лишние полосы расположены ВЫШЕ Вашего белка - это могут быть модификации, которые связаны с: фосфорилированием, ацетилированием и т.п. (масса белка увеличивается несильно) либо (!!!) убиквитинирование, сумоилирование и т.п. (масса белка увеличивается где-то на 20 КДа, причем иногда, если Вы везучая, возникает характерная лесенка фрагментов - БЕЛОК-БЕЛОК+20Кда-БЕЛОК+40Кда и т.д.) - мои поздравления, вы стоите на пороге одной из наиболее модных областей в современной протеинологии. Если лишние фрагменты НИЖЕ Вашего белка - к сожалению, это, скорее всего, протеолиз в ходе лизиса ткани и последующих манипуляций. Нужно найти более мощный ингибитор протеаз (а лучше сразу несколько), чем те, что Вы используете. О +4 градусах по Цельсию говорить, я думаю, излишне.

4. Никаких особых отличий в работе с моно- и поликлональными антителами нет. Вестерн (при прочих равных) ведется абсолютно одинаково. Моноклональные иногда дают более чистый сигнал (хотя это зависит от типа белка, его концентрации, метода лизиса и т.д. поликлоны могут быть абсолютно также хороши, как и моноклоны), и они, как правило, дороже. Именно поэтому для иммунопреципитации лучше пользоваться поликлональными. Для иммунопреципитации с моноклонами часто приходится использовать белок G (который также дороже, чем белок А). Таблицу использования белков А и G с разными типами антител можно найти, например, в биорадовском каталоге. Часто используют такой прием: иммунопреципитация поликлональными антителами - вестерн с моноклональными (наоборот - дороже, но тоже можно), во избежание регистрации сильно фонящих иммуноглобулинов. Если масса Вашего белка сильно отличается от 50 и 25 КДа (где-то там будут тяжелая и легкая цепи иммуноглобулинов, дающие замечательный сигнал на вестерне), то можно и преципитацию, и вестерн вести на одних и тех же антителах.

5. Удачи!

С уважением,

Алексей.

----- Original Message -----
From: Irina Corin
To: alexei@icp.ac.ru
Sent: Monday, June 23, 2003 4:28 PM
Subject: WB


Privet Alexei,

S interesom prochitala vashi rekomendacii. I hotya moi metod raboty s WB poryadochno otlichaetsya ot vami opisannogo,

Hotelos by obsudit nekotorye detali, kotorye mne ne ochen udayutsya.

Vozmozhno vy podelitis vashim opytom ili porekomenuete mne kogoto, kto na ,,nizheperechislennom sobaku s,el,,.

Prigotovlenie kletochnogo extracta iz tkani opuholi grudi. Rezultat WB otlichaetsya pri ispolzovanii raznyh protokolov.
Mne prihoditsya peregruzhat gel, t.k. interesuyuschii belok v ochen nizkoi koncentracii. Sootvetstvenno uzhasnaya i neubirayuschayasya nespecifika. Nahozhus pered vyborom Frakcionirovanie, Immunoprecipitaciya ili Fotoshop??
Na WB proyavilos neskolko polos s silnym signalom , kotorye podozrevayutsya kak ,, privedeniya,, . Chto by vyyasnit ih lichnost hochu provesti preabsorbciyu pervichnyh antitel s rekombinantnym belkom, kotoryi uzhe kuplen. Problema v tom, chto ya ni razu etogo ne delala i byla by rada sovetam i poskazkam.
Do sih por rabotala tolko s monoklonalnymi AB (kstati ot Santa Cruz) . Predstoit odolet Rabbit Polyclonal AB. Kakie osobennosti v rabote s poliklonalnymi? Slyshala, chto oni huzhe
Konechno imeetsya esche kucha melkih voprosov i detalei, no kak izvestno peregruzka kak gelya , tak i naroda vliyaet na kachestvo rezultata.



Zaranee blagodarna,

Irina..

ПОВЕРХНОСТНЫЙ ИММУНОБЛОТТИНГ
Процедуры переноса белков из геля на мембрану зачастую можно не выполнять!!!!! (A.Y.Plekhanov Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel.- Anal. Biochem., 1996, v.239, 110-111), а лишь наложить на гель мембрану (прикатать пробиркой для плотного прилегания) и выдержать 5 - 10 минут. Другую мембрану можно приложить к гелю с обратной стороны.
Чувствительность иммуноблоттинга при этом остаётся высокой (в наших условиях - ок. 5 нг антигена, содержащегося в геле, при проявлении пероксидазной метки антител бензидином).
Заметим, что из геля на мембрану при этом переносится лишь ничтожная часть белка с сАмой поверхности геля. Основная же масса белка остаётся в геле, что позволяет использовать гель так, как если бы с него не снималось никаких иммунореплик (окрашивание белковых зон в геле, электрофорез во втором направлении...)
Попробуйте! Вы в любом случае ничего не теряете: если в вашем случае метод не подойдёт - вы можете получить иммунореплику обычным путём (все белки же остались в геле!)
А.Ю.Плеханов

ПРОЯВЛЕНИЕ ИММУНОРЕПЛИКИ БЕНЗИДИНОМ
Далеко не всегда оправданно применение ECL: это дорого, не всегда нужна такая сверхчувствительность, да ещё плёнку проявлять... На самОм же блоте при этом никаких зон не видно.
Окраска бензидином (A.Y.Plekhanov - Anal. Biochem., 1996, v.239, 110-111) чувствительнее, чем диаминобензидином, фенилендиамином или нитрозо-нафтолом (хотя, конечно, менее чувствительна, чем ECL). Для тех, кто не в курсе: зоны антигенов при этом проявляются прямо на мембране, и окраска сохраняется неограниченно долго.
ПРАКТИЧЕСКИ, после отмывки мембраны от вторичных антител, её следует ополоснуть в дист. воде и поместить для проявления в раствор состава: 0,05% бензидина, 0,03% Н2O2, 0,002M лимонная кислота, 0,004М Na2НРО4 (рН 5). Перекись и бензидин добавляются перед применением. Бензидин удобно добавлять исходя из 5%-ного маточного раствора на спирту, затем проявляющий раствор следует подогреть до прозрачности, остудить до температуры ниже 40'С и проявлять. По окончании проявления мембрану промыть тёплой (40-50'C водой).
Если вы пользуетесь ECL, ПОПРОБУЙТЕ, по окончании экспозиции на плёнке, ополоснуть мембрану/фильтр/блот дист. водой и опустить в проявляющий раствор с бензидином - зоны у вас будут проявлены не только на плёнке, но и на самом блоте.
А.Ю.Плеханов.

Troubleshooting protein binding in nitrocellulose membranes
http://www.devicelink.com/ivdt/archive/99/03/009.html

Blocking strategies for nylon membranes used in enzyme-linked immunosorbent assays
http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/07/012.html

The use of microporous polymer membranes in immunoassays
http://www.devicelink.com/ivdt/archive/96/05/007.html

Здравствуйте! Я новичок в блотинге. У меня есть масса вопросов связанных с методикой приведенной ниже. Может они вам покажутся глупыми, но все-таки помогите в объяснении.
1. Чем отличается полусухой перенос от обычного и какое оборудование используется в 1ом и во втором случае.
2.Что такое куски Whatman 3 ММ, я знаю ватман обычный, но в силу своей неопытности хочу убедиться это он или не он.
3. В данной методике написан рецеп TS является ли он универсальным, т к у меня в инструкции к аппарату для блотинга написан состав TS немного с другими количествами компанентов.
4. И наконец, я не понимаю, что приоритетней напряжение,которое я выставляю на аппарате, примерно 14V или силу тока mA/см2.
Объсните пожайлуста!!! Плиззззз!

Обычный делается в том же станке, что и форез, только вместо стекол ставят кассету. Расход буфера - по объему форезной камеры. Для полусухого нужен специальный прибор с двумя большими электродами, между которыми закладывают кассету с гелем и нитроцелюлозой, обложенными фильтровальной бумагой. Расход буфера на порядок меньше.




Обычный ватман - это бумага чертежная, а 3ММ - фильтровальная, американская



Работайте по инструкции производителя (хотя, возможно, это не принципиально).




Блоттинг должен идти при постоянном напряжении, а форез - при постоянной силе тока.

Здравствуйте! Есть ли у Вас опыт блоттингового определения HIF-1a. Кыргызский научный центр гематологии зпланировал определение HIF-1a. Возможно-ли наладить данную методику и какое лабораторное оборудование необходимо для определения HIF-1a. У какой фирмы можно закупить оборудование.
Айнура Макешова, Кыргызстан
(AinuraMak@mail/ru

Здраствуйте,
Я пока еще новичок в блоттинге. И у меня вопрос по поводу применения вместо метанола этанола для PVDF мембраны.
Пожалуйста, ответьте
Оксана

сам не пробовал (использую только conventional methanol), однако мастера этого метода (Том1....) говорят, что можно.

Оксана, почитайте внимательно данную ветку.
сообщения 3 и 4:

во, блин - любитель пива и канабиса прав - помню, что где-то томову посту читал - а где, не помню

Спасибо, большое.
Сегодня же и опробую.

А мы делаем прямо наоборот!!! Это принципиально?!?!?!

--- мы делаем прямо наоборот!!! Это принципиально?!?!?!

Правильные пацаны все делают при постоянной силе тока.

Это не принципиально.

Если вы откроете школьный учебник физики и немножко подумаете, то быстро поймете в чем разница.

Вторичные козьи антитела

По-моему, это знают почти все, кто сталкивался с Western'ом, но в данной ветке я почему-то этого не нашел (может плохо искал- не знаю

В принципе, с козьими антителами инкубировать нужно в молоке или "другом блокирующем реагенте".
Совет, вобщем-то, хороший. Я, в свое время, его попробовал и не получил сигнала вообще. Чтобы такой ситуации не возникало в принципе, нужно подобрать разведение молока (или того, что в Вашей лабе привыкли использовать) для данного конкретного brand'a вторичных антител. Я рекомендую это делать последовательным разведением молока 1:3 от блота к блотy, пока не появится картинка нужного Вам качества.

Например, для goat anti-rabbit поизводства Jackson Immunoresearch (Cat# 111-035-003) подходит 0.5% Carnation Instant Nonfat Dry milk fortified with vitamins A & D. Не самое лучшее молоко, но в отличие от того что продает Fisher или Bio-Rad оно раз в пять или шесть, по-моему, дешевле и вполне работоспособно, если его фильтрануть через бумажный фильтр.

При подборе условий для переноса (особенно для больших белков, когда требуются более длительные времена - до 90 минут) очень удобны для контроля переноса на мембрану флуоресцентно-меченые маркеры. Тогда еще до проявления мембраны понятно прошел перенос или нет. В Sigma - они дорогие, а вот Fermentas выпускает их по вполне сносной цене - 1-2 мкл вполне достаточно на дорожку.

Vsem privet!
U menja takaja problema. Projavljaju blott ECL, a tam gutkij background, xotja moi belkovye bandy toge est'. Shef govorit chto problema v II antitelax, chto lipnut vezde kuda ne nado. Zabivku vedu 1 h v 10% moloke, ran'she vse rabotalo... Nikto ne stalkivalsja s takoj problemoj? Pomogite please!!!

Подскажите, пожалуйста, как наносить образец на гель после иммунопреципитации с сефарозой! Вот я добавила к сефарозной "лепешке" буфер для нанесения на гель, прокипятила 5 мин... А дальше? В карман нужно наносить только супернатант или пытаться засунуть туда и шарики сефарозы? Если да, то как? Срезанным носиком у меня не получается - они тящелые и падают на дно пробирки, как ни пипетируй! Или я могу быть уверена, что весь преципитированный белок перешел в буфер и в сефарозе ничего не осталось?
Заранее спасибо

кипятте фугуите и наносите супер.....

--U menja takaja problema. Projavljaju blott ECL, a tam gutkij background, xotja moi belkovye bandy toge est'. Shef govorit chto problema v II antitelax, chto lipnut vezde kuda ne nado.

Нужно немножко развести коньюгат. Если не поможет, то дело возможно в первых антителах или в плохом ECL

1.согласен с воприемником.
2. Если антитела ( первичные) козлины то вторичные обязательно делать в блокирующем буфере!!! иначе труба....
3. Настораживает "хотя мои белковые банды тоге есть " их что много??????

Я веду окраску блота последовательно двумя разными первичными АТ (на один белок и на другой), а затем все это вместе инкубирую со вторичным (благо одно и то же к обоим первичным). Так вот возник такой вопрос. Кто знает можно ли смешать в одном пузырьке оба первичных (оба мышиных) антитела (для экономии времени при оьработке) с учетом их последующего длительного хранения (использования)?

Кто знает можно ли смешать в одном пузырьке оба первичных (оба мышиных) антитела.

Можно, до тех пор пока не получите, какой-нибудь артефакт, связанный с неспецификой и перекрестной реакцией.

Спасибо

Пожалуйста,подскажите адреса фирм, где можно заказать аппарат для блоттинга.
Лена

---Пожалуйста,подскажите адреса фирм, где можно заказать аппарат для блоттинга.
Лена

На этом сайте раздел фирм посмотрите Биорад и Амершам(GE)

Люди знающие, откликнитесь! Что делать. Понсеан окрашивание дает хорошую картинку белкового разделения. Провожу гибридизацию с моноклональными а/т GAPDH в 5% молоке 1 час , комнатная температура, отмывка,1 час вторичные тела, комн.темпер, отмывка. детекция с ЕСЛ 1 мин, пробовала 5 мин. Получаю совершенно чистую рентгеновкую пленку. Оставляю блот на ночь при 4С, утром вижу черную полосу на месте миграции GAPDH,опять пытаюсь проявить. Пленка совершенно чистая, даже нет сигнала от маркера веса.
Пробовала с другими антителами ( другой белок) получила тоже самое. С данной нитроцеллюлозной мембраны считать ничего не возможно.
Заранее благодарна за любые комментарии.
Татьяна

Или вторые АТ или ECLка. Попробуйте к 0,5мл вторых АТ в молоке или ПБСТ (ну, в чем вы их разводите) добавить 0,5мл готового раствора для ECL. И бегите в фотокомнату - если будет светится, то все Ок, проблема не там или вторые АТ не связываются. Если не светитmся - меняйте реактивы для ECL.

Пожалуйста, кто работал с белком мол.веса 30, какое оптимальное время переноса и напряжение; а если белок 12кДА? лучшие результаты получились при 30 V, 6 hrs,но как то неустойчиво. То есть, то нет.
Спасибо за все ответы.

Спасибо Протеин. Я пробовала ЕСЛ на другом блоте, он работает, нормальная картина. А может это связано с праймеры а/т? Как вы различаете, где не работают прайймеры, а где вторичные? Заранее спасибо за комментарии
Татьяна

Провожу гибридизацию с моноклональными а/т GAPDH в 5% молоке 1 час , комнатная температура, отмывка,1 час вторичные тела, комн.темпер, отмывка. детекция с ЕСЛ 1 мин, пробовала 5 мин. Получаю совершенно чистую рентгеновкую пленку. Оставляю блот на ночь при 4С, утром вижу черную полосу на месте миграции GAPDH,опять пытаюсь проявить. Пленка совершенно чистая, даже нет сигнала от маркера веса.

--Провожу гибридизацию с моноклональными а/т GAPDH в 5% молоке 1 час , комнатная температура.

Маловато по времени 2--4 часа надо.

--Оставляю блот на ночь при 4С, утром вижу черную полосу на месте миграции GAPDH,опять пытаюсь проявить.

ОТКУДА !!??? У вас черная полоса??? Где вы оставляете блот на ночь? В каком растворе? или без раствора сухой?

----даже нет сигнала от маркера веса.

Объясните как каким боком, у вас может появится сигнал от маркера. Там что пероксидаза в полосах или у вас есть коньюгат антител с пероксидазой к маркеру и вы их добавляете во время связывания.

---Пожалуйста, кто работал с белком мол.веса 30, какое оптимальное время переноса и напряжение; а если белок 12кДА? лучшие результаты получились при 30 V, 6 hrs,но как то неустойчиво. То есть, то нет.
Спасибо за все ответы.

Какая процентность геля? Какую камеру для переноса вы используете? Без поямнений на ваш вопрос не ответитью. какой буфер используете.
12 кда обычно очень быстро переносится.

Спасибо большое за отклик. Блот оставляла на ночь при 4С в холодильнике, блокин раствор: 5% молоко в ТВС, 0,05% твин 20. Утром думаю повторить реакцию, глядь, а на блоте ткмная полоса на месте GAPDH, как обычно появляется, если антител очень много. Опять проявляю с помощью ЕСЛ, в темной комнате добавляю раствор ЕСЛ, как положено 1:1. Выдерживаю 5 минут раствор на блоте.Пленка чистая. Правда не ждала еще дополнительно 5 минут. Признательна за все обхяснения и ответы.

Еще раз, раствор в котором хранилась NC мембрана
трис, NaCL, dry milk, Tween -20 0.05%.

Камера, которую используем - Биорадовская, процент геля для 30 кило дальтон - 10%, для белка 12 кдальтон 4-20% гель.Обычный раствор как описано здесь на сайте, но SDS не добавляем.
Спасибо

---Спасибо большое за отклик. Блот оставляла на ночь при 4С в холодильнике, блокин раствор: 5% молоко в ТВС, 0,05% твин 20. Утром думаю повторить реакцию, глядь, а на блоте ткмная полоса на месте GAPDH, как обычно появляется, если антител очень много.

Вы сами то подумайте, если у вас нет субстрата для пероксидазы в вашем растворе, откуда образовываться красителю(темному). Это значит в вашем растворе есть что-то, что реагирует с пероксидазой и дает темную полосу. Спрашивается ЧТО ЭТО?
Ну допустим перекись может присутствовать в Твине, ну, а роль восстановителя кому отводиться?

Про окраску маркера пероксидазой на ЕСL так и не ответили.

---Камера, которую используем - Биорадовская

Вот вы интересный человек, у Биорада 3 камеры для мокрого переноса и одна для полусухого сухого. Знаете это примерно так! У вас какая краска для наружных работ или для внутренних. А в ответ: "У меня краска Шебекенского завода".

Короче, меня интерисует мокрый или полусухой и если мокрый, какое расстояние между электродами в камере.
Если мелкий белок бежит в градиенте, то нужны размеры геля(ток напряжение) и время фореза, что бы определить до пор какого размера добежал белок, или хотя бы где бромфеноловый синий, когда вы заканчиваете форез.

Net substrata dlya peroxidasi
Ya provodila deteciyu s pomoch'yu ECL na blote, poskol'ku plenka okazalas' absolyutno chistaya, ya reshila postavit' blot in refregerator in 5% milk TBS dlya otmivki overnight.Takoy priem mi provodim vsega, kogda provodim povtornuyu detecciyu. Ya bila obespokoena tem, chto net GAPDH. I utrom reshila ege raz postavit' reaciyu.Peroxidasa bila na blote i reakciya proizoshla znachitel'no pozge.Posle togo, kak Ya postavila blot in refregerator.Povtornaya detekciya i povtornaya reacciya nichego ne dali, hotya polosa ostalas' vidna na blote.

-ya reshila postavit' blot in refregerator in 5% milk TBS dlya otmivki overnight.

Блот перед этим споласкивали после ECL?

1)Капните на на кусочек мембраны сток коньюгата и забейте его молоком после этого сделайте ECL.
Если ответ есть, то пероксидаза коньюгата работает и нужно переходить к 2). Если ответа нет, нужен новый коньюгат.
2) Капните на кусочек мембраны первых антител забейте их молоком и проинкубируйте с коньюгатом. Потом проведите реакцию с ECL. Если ответ есть, то скорее всего у вас поганые антитела к дегидрогеназе, если ответа нет то у вас поганые антитела в коньюгате.

1.Восприемник я не перестаю удивлятся твоему долготерпению.....
2. Уважаемая все правильно написал "ммм", еще дополнительный вопрос, а положительный контроль у Вас имеет место быть или как??????

Я не думаю, что люди, которые собираются выравнивать пробы по GAPDH имеют в своем арсенале чистую GAPDH от Worthington, для плюс контрля, своего контроля.

Дык хотя бы екстракт в котором заведомо есть данный фермент ( хорошо бы провереным наличием по его активности)

Вы правы чистой GapDH у нас нет,пробы сравниваем - ложная операция, реальная операция.Проверила праймкры а/т и вторичные. На дот блоте хорошо себя проявили все антитела. А когда нанесла экстрагированный протеин, оказалось, что с концентрации 250 nM и меньше,ответа нет, чувстительность слабая. Количество белка, которое нагружаю - 30-35 mkg довольно прилично, почему не работает GAPDH в этих условиях - не понятно.
Спасибо за все комментарии

Уважаемый А.Ю.Плеханов обязатедьно попробую Ваш метод, он быстрее, а вот как с точностью,
С уважением, Татьяна