в общем прошу попинать ногами (по существу :)) следующую идею:
если исключить задачу сабклонинга пцр продуктов для хранения и амплификации, и рассматривать только задачу получения днк которая адекватно режется рестриктазами..то почему не попробовать:

1. для амплификации использовать полимеразу (смесь полимераз, если финансы имеют значение) генерящую blunt-ends
2. самолигировать пцр продукты в пэге (должны получаться конкатемеры?!)
3. резать полученную днк нужными ферментами (по идее такая днк должна резаться более адекватно?!)
4. чистить на форезе фрагменты адекватного размера и лигировать в целевой вектор?

Зачем такие сложности?

ну периодически у людей возникает проблема впрямую порезать+клонировать пцр продукт, всвязи с чем используют что-то типа т-векторов и топо-векторов..если исключить задачу сабклонинга для хранения и амплификации, "по идее" такая схема может сэкономить некоторое количество времени по сравнению с дополнительным клонированием через т или топо..

Mozet prosto praimeri adekvatnie zakazivat? Dobavte eshe 6 nukleotidov na kontsi i budet vam adekvatnoe schast'ye.

Ya vsegda PCR product srazu vv tselevoi vector kloniruyu takim obrazom.

2Vladimir70: я тоже вполне счастлив с адекватными праймерами, без т-векторов и остального...но яже просил _по существу_?! :-)

пункт номер три - поподробнее. что Вы имели ввиду?

а что значит резаться "адекватно" ?????

2Павел&Egil
бытует такое мнение (обычно когда не получается проклонировать сразу после пцр) что рестриктазы плохо режут на концах пцр продуктов, существенно хуже чем если вырезать из кольцевой или просто длинной молекулы днк

эээххх... Когда не клонируется, то не всегда нужно "винить" плохость рестриктаз, ткскзть.. Может быть тыща других причин. Кстати, на сайте neb.com поищите табличку - сколько буковок "довешивать" на 5'конец праймера, чтобы продукт ПЦР можно было дорезать..

хм...ещё раз хотел попросить _по существу_
// табличка имеется в 2х экземплярах...проблем с клонированием НЕТ...

где Вы сказали неправду?

флудеры вы господа...

тему в топку пожалуйста

Схема, предложенная Вами, абсолютно адекватна поставленной задаче!
Более того, она, естественно, работает.
Но она немного тяжела и требует экспериментальной проработки, а все другие способы направлены на упрощение процедуры клонирования.
Наверное, иногда ею не пользуются также по той причине, что не фосфорелируют праймеры, содержащие по концам сайты, а когда фрагмента много, лень снова возвращаться к ПЦР.

<<по той причине, что не фосфорелируют праймеры, содержащие по концам сайты<<

An ne perevelis eshe umnie lyudi v Zemle Russkoi ;-)))

вообще говоря схема работает хреново и сильно рестриктазо-зависима. Хреново в том смысле, что клонируется много грязА. Потому так лучше не делать, а лепить-таки концы для рестрикции на праймеры.