Уважаемые коллеги!
Подскажите, пожалуйста, кто знает: всегда ли при работе на проточнике на развертках (сигнал флуоресценции х события) должны быть четко разделены пики негативной и позитивной популяции? Так получается и к этому я стремлюсь при работе с клетками крови, окрашивая их антителами. А попробовав померить эффективность трансфекции по GFP у меня вместо того, чтобы появиться позитивной популяции GFP-положительных клеток, просто сместился максимум аутофлуоресцирующих клеток и еще увеличился по высоте. 1) Это нормально? 2)Как лучше оценить эффективность - от точки пересечения? А если максимум GFP-позитивных клеток такой большой, что полностью "поглотил" аутофлуоресценцию - это "зашкал"? Или надо было менять настройки напряжения, добиваясь отсутствия "зашкала" и появления двух популяций - позитивной и негативной? Пожалуйста, оптыниые люди, поделитесь Вашим опытом. А если у кого есть, может, статьей на эту тему?

В чем проблемы? GFP светит в FL-1
Сигнал не обязательно разделены - обычно будет "хвост".
Посему и требуются все необходимые контроли- исходные клетки до трансфекции, и трансфецированные тем же вектором, но без GFP reporter-а.
Тогда сразу все вопросы по выделению нужной популяции и отпадут.

Спасибо Вам огромное за ответ! Все поняла, единственное, меня волнует "зашкал", который проявляется в том, что "хвост" не сходит "на нет" к концу области. Может, надо было по этому максимальному сигналу снижать напряжение? Или это необязательно?

По контролям voltage выставляйте. В приниципе,"зашкал" не критичен,однако- не эстетичен.
Прибор какой? В некоторых случаях (еслиу цитометра динамический диапазон мал, а семпл- слишком яркий) от "зашкала" избавиться не удастся (ну разве что если весь контроль на ось загнать).

Вольтаж выставляли по контролю. Зашкал, действительно, не эстетичен. Прибор Beckman Coulter Epics XL

Ну да, старенький дивайс. Не пяти-шести декадник и без би-экспа.
Картинки полученные можете вывесить здесь в теме (для контролей и эксперимента)?

Дядя Факсер Вам уже на всё ответил, но пара добавочных штрихов

Если у вас бегут 50 бегунов то всегда ли лидеры отрываются от аутсайдеров на 3 км? Вот и с маркерами так же. Если речь идёт о CD нашем 4, например, то клетки либо позитивны, либо нет. Поэтому и четкое разделение пиков.
А если у вас экпрессия протеина после трансфекции то, естественно, Вы получите непрерывное распределение от 0 до максимума смотря по интенсивности синтеза оного протеина в каждой клетке. Если смотретъ часов через 6-12 после трансфекции позитивная то популяция может выглядеть как непрерывный хвост. Позже позитивные клетки могут сбиться в кучку и хвост станет «жиденьким», но скорее всего останется.



либо
1) эффективность близка к 100% и почти все клетки стали зелёными
2) Вы используете трансфецирующий агент который очень сильно флюоресцирует.
3) Ваш способ трансфекци просто убил все клетки


1) замеряем флюоресценцию mock-transfected клеток (только вектор, «пустой»)
2) выставляем границы области позитивности так, чтоб в mock-transfected образце получалось 10% «позитивных» клеток.
3) смотрим сколько позитивных в настоящем образце, вычитаем 10%. Получаем эффективность трансфекции.




ммм ... можно картинку вклеить, потому как не совсем ясно о чем бишь речь. Аутофл это минимум, максимум позитивности это максимум. Как максимум может поглатить минимум?

Уважаемые коллеги Дядя Факсер и Леонид В! Огромное спасибо за вашу отзывчивость - вы мне очень помогли.

Вот картинки - контроль и опыт, которые мне не нравятся:

control.bmp размер: 138.22 кол-во скачиваний: 55

exp.bmp размер: 199.78 кол-во скачиваний: 58

.

To Дядя Факсер: я не понимаю вашей фразы "Не пяти-шести декадник и без би-экспа."

То Леонид В: почему вы предлагаете сделать так: " ... выставляем границы области позитивности так, чтоб в mock-transfected образце получалось 10% «позитивных» клеток. 3) смотрим сколько позитивных в настоящем образце, вычитаем 10%. Получаем эффективность трансфекции....".

Не могу пока разобраться, как же все-таки выбирается область позитивности так, чтобы избежать ложно-положительных результатов (взят контроль) и ложно-отрицательных результатов (урезан опыт)?. Наверное, это математически грамотно должно обосновываться и быть заложено в программе обсчета данных? По литературе пока нашла, что при сравнении гистограмм флуоресценции (являющихся распределениями частот встречаемости клеток с определенной интенсивностью флуоресценции) используется критерий Колмогорова-Смирнова. Вот ссылка на статью. И еще попалось в литературе, что левую границу позитивности определяют как: Cells positive for GFP expression were defined as those cells with fluoresence levels two standard deviations above the median fluorescence levels of the uninfected cells. Я работаю в программе WinMDI2.8. и там ничего такого я пока не нашла....

это правильный, очень-очень правильный подход. И в программе CellQuest, например, есть возможности для этого. И если у Вас есть время, очень-очень много лишнего времени, то необходимо делать именно так.
Но это немножко напоминает отсыл линейки в Палату Мер и Весов для апробирования перед каждым замером длинны остатка хвоста у мыши (в работе по изучению влияния тотального отрубания хвоста на длинну оного).
Пусть немножко, но напоминает.

то что написал, совершенно не маткорректно. Просто возмутительно не маткорректно. Но работает. И позволяет двигаться вперёд, а не решать задачу повышения точности измерения обрубка хвоста.

По картинкам:
рекомендую в качестве контроля использовать пустой вектор (mock). Шестое чуйство говорит, что возможно увеличение аутофл после трансфекции Вашим липофектамином (?) или чем-то еще.

рекомендую настоятельно проверить жизнеспособность Ваших клеток после трансфекции (просто трипанкой)

если возможно, клейте сюда не только и не столько гистограммы, сколько dot-plot, например FL1/FCS. Он куда более информативен при поиске ответов на вопрос «Ой! А как это оно так вышло?!»

Если зашкал не даёт уснуть спокойно, то есть два варианта.
1) смотреть раньше. Не через 12, например, часов, а через 6
2) (очень неправильный подход). Смотреть в оранжевой части спектра (FL2). eGFP хоть формально и зелёный, но в оранжевом светит за милую душу. Результат будет «загрублен» и зашкал исчезнет.

PS не по теме.
дядя Факсер оченно полезное объявление разместил, про осеннюю школу по цитометрии . Загляните ...

Леонид В! Огромное-огромное спасибо за все советы! И за ссылку на школу! Удачи вам в вашей дальнейшей работе!

Используйте 7-AAD чтобы определить экспрессию GFP только в живых клетках. PI не пойдет, не сможете скомпенсировать PIvsGFP. Если все клетки живые и экспрессия на самом деле высокая, можете попробывать их зафиксировать - уровень флуоресценции упадет и будет вам счастье.

Почему же нельзя GFP + PI, очень даже можно!

Все верно: если PI много не лить и с вольтажом аккуратным быть.
Вот ежели одновременно смотреть и GFP и цикл (или апоптоз, или плоидность)- то тут "краснуху" надо использовать.

P.S. Справа стрелочка- нелогична: она должна бы от gated-out популяции идти (PI-neg)

"Вот ежели одновременно смотреть и GFP и цикл (или апоптоз, или плоидность)"

А почему нельзя добавить к GFP + PI еще и annexin V - APC?

Красивая картинка. Один нюанс - мы не знаем какая конструкция была использованна вопросзадающим. У вас все GFP+ клетки сидят во второй декаде, т.е., я так думаю, что GFP у вас не из под CMV промотора или же он fusion с protein-of-interest. Иначе чистый GFP из под CMV лежал бы далеко за четвертой декадой и shкалил бы на FL-2 так, что было бы проблемно компенсировать..

Я имел в виду анализ всего по DNA content.

несколько примеров по теме:
1 - клетки от GFP-трансгенных мышей
2 - культура до трансфекции GFP-гена
3 - после трансфекции

1.


2.


3.