Dorogie tovariwi,
Problema strashnogo haraktera, pugaet vsyu labu.
Rastut kristalli belochka. Rastut igolochkami, ne slishkom tonki, ne slishkom korotki - sobrat' mozhno bilo bi, ESLI bi ne odna problema. Kak tol'ko drop otkrivaesh' - vse srazu v kaple strashno presipitiruet, osazhdaetsya tak, chto nikakih kristallov, NICHEGO!!!!!!! Chelovechek plachet!!!!!!! Uzhe....rastish', rastish', a oni osazhdayutsya, kak tol'ko sobiraesh' ih dlya poezdki na sinhrotron=(((((((( Usloviya dlyua rosta ktistallov toka takie poka udalos' nayti (+22C):

0.1 M Phosphate-citrate pH 4.0
0.1 M Li2SO4
18% peg1k

Esli hot' kto-nibud' smog bi hotyabi malen'kim sovetom pomoch' - budu bezumno priznatel'na i otblagodaryu shokoladkoy))))

Spasibo vsem otkliknuvshimsya!

U vas malo informacii poka.
chto za tray? kak visjat/sidjat kapli? chem zakrito? kaoj sostav v reservoir well? gde kristalli rastut - na air/drop interface or na drop/plate interface?

kogda otkrivaete to kaplja bistro mutneet, tak chto li?

mi rastim kristalli v 48-well handing drop, vapour diffusion. Kaplya sidit na cover-slip, po-moemu on siliconized. Kristalli rastut na drop/plate interface preimuwestvenno, estestveeno kakya-to chast' kristallov v kaple plavaet, no na poverhnosti ih malo.
sostav reservoir well:
0.1 M Na Phosphate-citrate pH 4.0
0.1 M Li2SO4
18% peg1k

I da! Mutneet pochti srazu, kak cover-slip otkrivaesh'.... i mgnovenno, esli dobavlyaesh' reservoir solution, mutneet medlennee esli dobavlyash' rastvor s 10% glycerol.
Vot...

Всё с руками оператора в порядке! Никаких проблем нет!
Старшие коллеги пожимают плечами и говорят "хм". Европа...
Хахалей мне лично и тут хватает) А хахаля по буковкам и знаниям структурной биологии не выбирают :р
Прежде чем кристаллы мерить, их надо ВЫЛОВИТЬ, что и представляется задачей сложной в данном случае.........................
Меряем на синхротроне в Гренобле. Наш in-house на такие маленькие и тоненькие кристаллы особо не рассчитан, кроме того, это кристаллы coiled-coil белка...разрешение не особо хорошее...тем более, это только первые популяции кристаллов....
И какой же антиоксидант вы посоветуете?
Хотя в Hampton я поищу...если чего советуют..

P.S. транслит не транслит...какая разница, по-русски же) смс-ки же тоже латиницей до сих пор пишут многие..
Но мне не трудно.

а вы уверены что это не соль? особенно если это коилд-коил, и насколько я знаю прежде чем на синхротрон везти все равно надо предварительно посмотреть на том, что имеется поблизости

и это... думайте о них как о lovely crystals

Катя, я Вам после работы отвечу... Или если кратко - DTT, меркаптоэтанол, но там может быть проблема с S-S связями в белке и изменением структуры его.
Не соль - посмотрите в других лунках.
Остальное серьезное - после чайника - нет, так что работайте спокойно.

Спросите на синхротроне, что им нужно и в какой форме выловленное, там вот смски могут быть полезны.

А относительно выдачи мне шоколадки - пишите в почту.

Возможно, еще что посоветую... Только вот... Увидел сегодня на майке у девушки понравившуюся мне надпись I knew about the risks.

Удачи.

На синхротрон мы едем сами)) Для него особых требований нет, кроме как, имения тех самых выловленных и замороженных в лупах кристаллов. Кристаллы точно белковые...не соли. В UV светят хорошо, крутят свет...всё прекрасно. Только выловить никак нельзя...только открываешь дроп, лезешь в него лупом и ВСЁ! никаких кристаллов. Только в этом и проблема...
Как уже об этих кристаллах не думали(
Окисление там...
Кристаллы воспроизводятся, всё с ними ок. Пробовали различного рода добавки...более 100...осаждается всё в дропе, как только вмешиваешься в кристаллизационный интим((
ДДТ может помочь, да? попробуем....

P.S. Это тоже я. Или сверху налейте чего в лунку, будут кристаллы в масле. Такие не пойдут в Гренобле?
Если руки жОстко трясуЦЦа, то попробуйте коллег попросить.

Katya, eshe paru voprosov:
kakoj sostav v kaple belka
kakoj objem kapelek belkovogo rastvora iznachalno vi sadite v well
namereni li vi polzovatsja cryoprotectant i kakim (sootvetstvenno sobiraetes li vi morosit udachnij kristal v azote ili net, dumaiu chto taki da)
tolzhina igolochek kakaja? ~ 50-100 mkm?

i eshe odin
vi na zamutnevshuiu kapelku v mikroskop mozhete posmotret? ~ x40 ili x50? chto vidite? flakes iz nepravilnih chastichek ili iz malenkih kristallikov?

Ох....Кристаллы эти самые не мои, а моей коллеги....но она австрийка, а у них таких ресурсов нет =(((((
Сами мы PhD студенты в Австрии, всё нужное имеется для кристаллографов. Ну если ими не тыкать сильно в кристалл, то не повреждают, как правило ничего плохого они не делают.
Эх...не уверена, что у нас есть краник с азотом((( Это я предлагала.....в комнате с микроскопом не открыть.
Если однажды капля осадилась, то безвозвратно.
У нас не такие тарелочки)) У нас handing drop.
Руки нормально..не трясутся. Они начинают трястись, когда уже во второй капле такой пипец случается....

Итак, белок находится в растворе:
20mM Tris pH=8.0
100mM NaCl
5% gluycerol

ну капельки разного размера, кристаллы растут как в 1 мкл белка+1 мкл раствора иди 2 мкл белка+1 мкл раствора

Конечно используем. В данном случае используем глицерин 20% и пег 1К увеличиваем до 25%.

толщина иголочек не более 50 мкм, даже может менее.
Они тонюсенькие...но мы такие тоненькие возили уже на синхротрон. Там на них стрельнуть можно.
Помотреть на неё можно, но там ничего не разобрать. Очень тяжёлый пресипитат. Кристаллов не видно воооооообще.

P.S. шоколадка будет, если-таки коллега хотя бы одну каплю спасти сможет...ей эта структура очень нужна. Уже третий год закочнился...она мечтает закончить.

Вот в какиъ тарелочках мы кристаллизуем http://hamptonresearch.com/product_detail....&sid=181&pid=68
Спасибо вам за то, что пытаетесь помочь)
Руководитель наш от этой ситуации отмахнулся...

Katya,
vot, kak mne kazhetsja, sut vashej problemmi. Posle sealing cherezz kakoe to vremja (kakoe?) v kaple poiavljaiutsja protein crystals. K etomu vremeni kaplja umenshaetsja v razmerah - isparenie vodi iz kapli v well. Sobstvenno, eto isparenie i controlliruet kristallizasiu (no ne toko ono). Nesmotria na to, chto cheres kakoe-to vremja growth rate of crystals umenshaetsha v kaple imeetsja vse eshe mnogo proteins. Ochen mnogo. T.e. v kaple k momentu otkrivania est odna phase eto crystals (s prilegaiushim sloem rasstvora) kotoraja sosushestvuet s koncentrirovannim protein solution phase. V moment otkrivanija v well popadaet laboratornij vozduh s MENSHEJ vlazhnost'iu i isparenie s poverhnosti kapli ispitivaet skachok, za malenkoe vremja ispariaetsja to dobavochnoe kolichestvo vodi, kotoroe perevodit high concentrated protein solution from the liquid state v gel, flakes or whatever your call. Rastvorennij belok intensivno vivalivaetsja iz kapelnogo rasttvora v aggregati i tem samim umenshaetsa ego koncentrasia i v rasstvore kapli i vblisi gotovih kristallov. Chto pri etom proishodit s kristallami? Pravilno, v otvet na umenshene protein concentration in solution crystals nachinaiut rastvoriatsja. Sudja po vashim rasskasam bistro.
Vot kak-to tak.
Vazhno v etom dele to chto agregati rastvoriatsja v ishodnij rastvor ne mogut, a kristalli mogut.


Kak eto proverit?
1. Ubedites, chto agregati kotorie vi vidite kak mutnost eto proteins
2. popitaites poigrat enviromental humidity, naprimer sdelaite ee zavedomo visokoj, i otkrojte well, pri etom mutnosti ne budet, no kristalli skoree vsego vsetaki rasstvoriatsja, no po drugoj prichine - kondensasiaj vodi v kaplu budet visokoj
3. esli #2 rabotaet imenno tak kak ia napisal, to vse chto vam nado eto podobrat enviromental humidity v moment otkrivanija, kotoraja ostavljaet vam razumnoe vremja
dostat kristall, soak it and cryo-protect it.

I have some ideas now! Thanks a lot....I think we will try it and also play with the humidity and water content. If it will work it could be great =))))
Danke!

Не слушайте советов про восстановители (ДТТ и т.п.) - это будет сразу ненативный фолд, структуру с этих кристаллов вы нигде потом не опубликуете!

Мой совет такой: любым способом при раскрывании стрипа выровняйте влажность с той, при которой кристаллы с каплей стабильны. Если нужно - напроситесь на открывание стрипа в лабу в которой есть полностью изолированная камера со стеклом и манипуляторами/резиной для рук, там должны быть условия кристаллизации.

После открывания капля должна мгновенно упасть в очень большой избыток раствора, в котором белок стабилен. Кристаллы при этом выживут, а преципитация не успеет произойти из-за эффекта сильного разбавления, там не должно быть мешалок, ломающих кристаллы, которые упадут сразу на дно, где их можно будет подобрать чем-то вроде микроманипулятора или токим носиком засосать в пипетку для переноса-перевозки.
Постарайтесь после того, как капля БЕЗ ПРЕЦИПИТАЦИИ упадёт в избыток объёма раствора-стабилизатора подобрать кристаллы со дна сосуда за короткое время - они хоть и стабильны должны быть, но эффект разбавления будет медленно но верно кристаллы растворять. Может быть и быстро, сами понимаете, в большой концентрации компонентов по закону Гиббса равновесие направлено в сторону кристаллов, в микроскопической же концентрации (которая спасает от преципитации наглухо) даже в составе кристалла это равновесие будет смещено в сторону его растворения. Работа будет - в скорости и минимальном преодолении критической концентрации преципитации над кристаллами в момент падения капли в некий избыточный объём.
Ни в коем случае не добавляйте химикаты, меняющие окислительно-восстановительные условия вокруг образовавшихся кристаллов - работа станет непубликабельной.

Также ВСЕХ прошу пользоваться кнопкой транслит и печатать на русском, по возможности. Но тут ситуация у топикстартера аховая, потому придираться не собираюсь.

Protein Sci. 2005 October; 14(10): 2610–2621.
doi: 10.1110/ps.051632905

PMCID: PMC2253300
Copyright © Copyright 2005 The Protein Society

Crystal structures of oxidized and reduced forms of human mitochondrial thioredoxin 2
Aude Smeets,1 Christine Evrard,1 Marie Landtmeters,2 Cécile Marchand,2 Bernard Knoops,2 and Jean-Paul Declercq1

Crystallization
The initial hTXN2 protein crystals were grown in 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.6), 22% (w/v) PEG 3350, 1 mM 1,4-dithio-dl-threitol (DTT) as antioxidant, and 0.02% (w/v) sodium azide by the hanging drop vapor diffusion method at 18°C, using a protein concentration of 6 mg mL−1. The volume of the crystallization solution was 500 μL, and the crystallization drop was formed by mixing equal amounts (2 μL) of the protein solution and of the crystallization solution. Crystals appear after 3 d. They look like thin plates and grow to a size of 0.4 × 0.4 × 0.05 mm3. All of the attempts to grow crystals in the absence of DTT were unsuccessful. The oxidized form of hTXN2 was obtained by soaking already grown crystals in 1 mMH2O2 for 90 sec. Many unsuccessful trials were made to get the reduced form of hTXN2 by soaking in DTT or β-mercaptoethanol at different concentrations and for different durations, and finally it was obtained by soaking crystals for 90 sec in 10 mMTris(hydroxymethyl) phosphine.

Относительно "Ни в коем случае не добавляйте химикаты, меняющие окислительно-восстановительные условия вокруг образовавшихся кристаллов - работа станет непубликабельной." - некая логика есть. И технические аспекты отлова кристаллов описаны неплохо.

тиоредоксин относится к той редкой категории белков, где окисленный и восстановленный белок в форме структуры очень интересны.

если кристаллизация идёт без восстановителя и белок структурный или рецепторый, то изменение степени его окисления делает работу крайне труднопубликабельной.

так как кристаллы уже получены без восстановителя, то нужно любой ценой донести их до синхротрона без изменения состояния их окисленности.

Структурные и рецепторные белки тоже могут сильно менять конформацию при изменении редокс потенциала среды. Как один из механизмов регуляции.

С тем, что лучше не менять состояние белка на поверхности уже полученных кристаллов и что скорее всего Ваши советы очень полезны и никакой DTT тут не нужен - согласен.

повреждённые в ходе подготовки in vitro ненативные конформации белков никому не интересны.

если только предварительно не доказано, что все цистеины в правильно функционирующем белке in vivo являются восстановленными. это достаточно редкий случай. мне только цинковые пальцы приходят в голову.

Сложнее, но давайте закончим. Кристалл как читается? Не очевидно, что повреждение или изменение структуры на поверхности окажет эффект на общую диффракционную картину. Это уже к физикам вопрос, давайте здесь остановимся в силу времени/тематики и общего удручающего уровня подавляющего числа участников не нашего сайта/других факторов.

Нет. В белке, очевидно, есть микроокружения аминокислот, поэтому не очевидно, что даже в сильном восстановителе все будет восстановлено.

Дорогой NMR-guy, огромное спасибо за такие интересные советы) Мы уже с коллегой посоветовались и придумали пару фишек с влажностью и способами её регуляции. Бокс с регулируемой влажностью мы не создадим, конечно, но кое-какие идеи в русско-австрийский мозг пришли)
Про использование ДТТ и чего-то похожего.....я как-то не люблю кристаллы обижать...они все уж очень разные и никогда не знаешь, какой и как отреагирует на то или на другое....
Некоторые растворяются при изменении температуры, когда их ловишь, некоторые нет. Некоторые ломаются чуть их тронешь, некоторые нет....
Никогда не угадаешь)
А про Европейскую науку....денег много, мозга не очень. Вот....
Наши хоть по сайтам сидят, но они месяца изобретательностью и смекалкой экономят, пока европейцы/американцы эксперименты годами повторяют...
Но не всё так плохо...но не фонтан.
Ещё раз огромное всем спасибо)

Вы, Катя,
ради чистого, так сказать искусства, напишите как вам удалось победить мутность, и удалось ли.

Можно попробовать радикальный метод - сейчас некоторые синхротронные станции предлагают возможность тестировать (а при удачи и снять данные) непосредственно с кристаллов в плашке. В основном это относится к 96-луночным плашкам для сидячих капель, но все может быть. Как правило, пучок на таких линиях очень тонкий и можно даже выбратьотдельный кристалл в капле.

как вариант попробуйте counter-diffusion метод в капиллярах (здесь можно купить http://trianatech.com/index.php?option=com...emid=88&lang=en , если кристаллы появятся, то можно прям в капиллярах снимать
либо попробуйте microbatch under oil - если кристаллы появятся, то когда вы их будете вылавливать, то они покроются слоем масла, которое защитит их от высыхания:-)
да и вообще получается контакта капли с воздухом вообще не будет:-) удачи!

Чисто логически это может быть три вещи:
1) Окисление из за соприкосновения с кислородом. Что бы это проверить, по пробуйте должить 1мМ DTT и к белку и в reservoir solution. И это все неправда что dtt это не натурально, и тд. Извлечение белков и последущия кристализация и так не натуральна, по эотму использовать можно все что угодно что бы получить структуру. "Натуральность " структуры всегда проверяится мутациями потом или насколько много опубликованных in vivo наблюдений она может обьяснить. Так что я попробовал бы, легко устроить. Если кристалы долго растут, побробуйте TCEP, он дольше держится. Я бы сделал три реакции, 5мМ BME, 1mM DTT, 1mM TCEP. Еще можно понятно проверить открывая резервуар в аяоте или аргоне. Их можно везде всегда купить в баках, аргон должен продаваться в магвзинах для сварки.
2) Изменение влажности при открывани. Это тоже не сложно проверить, купите за 20$ увлажнитель, найдите самую мелкую комнату, поствьте там работать увлажнитель на полную, и и там откройте свою реакцию.

3) Какие то пары накапливаются в резервуаре и когда выходят, то у вас пресипитант. Тогда надо на синхотрон ехать с пластиковыми плашками, там обычно мелкии кристалы так как обьемы мелкие но можно не открывая резервуара.

Если причина в слишком большой концентрации веществ в капле (что несколько странно, учитывая условия кристаллизации) можно попробовать разные вещи:
1. При открывании сразу добавить раствор-осадитель примерно в соотношении 1:1 - это может увеличит1 время выпадения осадка
2. если выпадает соль, то поставить стеклышко на очень короткое время против воды в такой же плашке. Кристаллы соли растаят через какое-то время. Но процесс чреватый, можно передержат и тогда придется белок перекристаллизовывать.
3. попробуйте растить при пониженной температуре, например +4С. Тогда равновесие будет достигаться медленнее и кристаллы могут вырасти крупнее. Но могут и не вырасти, могут даже совсем не вырасти.
4. Как советовал HotRider попробовать вырастить в капиллярах. Непросто, но в капилляре даже можно снять. Опять таки могут и не вырасти.

Кстати, 50 мкм в поперечнике не так уж и плохо - я с таких кристаллов на старом DESY снимал выше 2А, правда белок был небольшой.

Saxon Mullins 123VEGA says she once had PRAGMATIC PLAY romantic dreams of what her 'first time' would ICONIC GAMING be like. In none was หวยปิงปอง she paralysed by fear in a Sydney ปั่นสล็อต alleyway, aged 18, with a 123GOAL man she had met only minutes earlier. Ms 88KTC Mullins has always maintained FC SLOT this incident - in 2013 - was rape. It spurred AMB CASINO her to push for legal 11HILO reform in Australia, after a long court battle ended with a judge finding the man involved did not realise she hadn't consented to sex.