Если делаете ампликоны (16S РНК правильно???) с единичной клетки, зачем тогда НГС???

16S ПЦР спокойно поднимет и с одной клетки

Если мне не изменяет мой склероз, у простейших должна быть не 16S, а 18S РНК. Причём идентифицируют их обычно по последовательности митохондриального гена cox1. У него копийность выше.

нет, почему? НИИ ФХБ часть Университета.
А wga штука коварная. Хотя для 18s сойдет.

Появилась новая разновидность ПЦР c большей чувствительностью: PCDR

http://www.biotechniques.com/Biotechniques...ues-339744.html

http://www.biotechniques.com/Biotechniques...ues-353302.html

По-моему, это тривиальное сочетание гнездовой ПЦР с SDA в духе MDA. Т.е. MDA с двумя парами специфичных праймеров. Мне когда-то попадался на глаза патент на MDA с несколькими специфичными прамерами. Так что ничего нового в PCDR, похоже, нет. "Повторение пройденного" в упрощённом формате:
http://www.jpbsonline.org/article.asp?issn...ulast=Fakruddin

Ну, нового возможно и нет, а увеличение чувствительность на несколько порядков есть

чувствительность обычной ПЦР - десяток копий в реакции. Если добавить несколько порядков, то мы переходим на метафизический уровень.

Даже детекция единичных копий есть огромное зло ясчитаю, особенно в диагностике инфекций, можно найти все что только существует

Это же касается и НГС из 1 пг РНК - концов не найти....., насеквенировать можно все что угодно.

http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=550997

Во вторник (21 октября) Термофишеровцы объявили о замене полимеразы, что позволит повысить точность чтения:
http://news.thermofisher.com/press-release...icon-sequencing
Называется это Hi-Q. Пустячок, а приятно. Тем более, что выпуск чипов PII перенесён на следующий год.

Ещё одна новость - появился PGM Dx (т.е. "диагностический"). Правда, пока только на сайте, и только для заказчиков из США. Непонятно, чем он отличается от обычного PGM. Скорее всего, это немного улучшенная модификация с отличиями только в программном обеспечении, да и то с чисто внешними.

Я не знаком с технологией NGS и мне требуется небольшая консультация профессионала. Подскажите пожалуйста - фирма FTDNA предлагает следующий продукт.
"The BIG Y product uses next-generation sequencing to reveal genetic variations across the Y-Chromosome:
Targeted Non-recombining Y-DNA sequencing
Illumina HiSeq 2000
55X to 80X average coverage
Around 11.5 to 12.5 million base-pairs of reliably mapped positions of non-recombining Y-Chromosome
Analyzed using Arpeggi genome analysis technology for improved variant calls
All samples are processed in-house using our custom laboratory methods and informatics. Your sample never leaves our company and is never shared with outside vendors.
The VCF and BED files will be available for download on your results page. For our users’ convenience, we will format raw results in .BAM format. You may request your file by contacting helpdesk@familytreedna.com." Вопрос такой: на сайте YFull предлагают прислать этот BAM файл и на его основе определить митохондриальный гаплотип. Как такое возможно? В этом продукте секвенируется тотальная ДНК и BAM файл содержит и мито последовательность тоже?

Вы ничего не перепутали? В верхней части странички сайта с вопросами и ответами о BIG Y есть рекламка теста Family Finder + mtFullSequence (298$). В самих ответах митохондриальная ДНК не упоминается:
https://www.familytreedna.com/learn/y-dna-testing/big-y/

Насколько я понял, BIG Y - это таргетное секвенирование нерекомбинирующей части Y-хромосомы на HiSeq 2000 (11,5...12,5 млн.п.о. с 55...80-кратным чтением). От всего прочего избавляются гибридизацией. Если очистка не идеальна, то в образце могут оставаться следовые количества митохондриальной ДНК. Да и специально захватить её не сложно. Странно, что они этого не делают.

Да FTDNA в BIG Y ничего не говорит про мтДНК. Такую услугу оказывает сервис YFull. я прочитал об этом на форуме "Молекулярная генеалогия". Люди высылают BIG Y RAW файл и на YFull определяют МИТО гаплогруппу. Мне это показалось невероятным. Если в образце остаются следы мтДНК, то она будет отсеквенирована? И будет ли возможно данные по мтДНК извлечь из RAW файла или то что предлагает команда YFull это лажа?

От митохондриальной ДНК не так то просто избавиться, поскольку в клетке её тысячи или даже десятки тысяч копий. Так что теоретически всё возможно. Если кто-то уже убедился, что последовательности мтДНК присутствуют в данных BIG Y, то не вижу поводов для сомнений.

genseq, спасибо за разъяснение.

Оценка качества секвенирования на MinION (Oxford Nanopore) японцами (А. Михеевым):
https://vk.com/doc168842140_329630460?hash=...9df4a80bdf87c78
Качество не плохое, а отвратительное. Идентифицировать удаётся не больше 10% получаемых последовательностей, а для получения более-менее внятной информации нужно многократное чтение.

вот спасибо - хотя я с этим мнением знакома, но конкретную статью пропустила.

потомок Чингиз Хана ?

хи куку проверил не лучше такары

маш читайте книги иссточник знанья

Есть две новости про NGS. Хорошая и плохая. Начну с плохой.

Иллюмина в понедельник анонсировала свои новые достижения в области секвенаторостроения. Все достижения сводятся к тому, что секвенаторы HiSeq X, которые в прошлом году продавали исключительно оптом (по 10 шт.) в этом году будут продаваться комплектами по 5 шт. (HiSeq X Five System) и даже поштучно (HiSeq 3000/4000):
http://www.illumina.com/company/news-cente...?newsid=2006979
Новость не такая уж и плохая, но уж очень непритязательная.

Хорошая новость пришла из Китая (BGI). Китайцы в самом конце прошлого года опубликовали работу с результатами испытаний Irys System (BioNano Genomics):
http://www.bionanogenomics.com/
Эта технология позволяет строить что-то вроде карт рестрикции очень длинных молекул двунитевой ДНК (картировать сайты никазы Nt.BspQI). Апробировали систему, естественно, на геноме китайца. Получили массу информации о делециях, инсерциях и повторах, которые не выявляются обычным секвенированием коротких последовательностей:
http://www.gigasciencejournal.com/content/3/1/34

А чем это лучше optical mapping?

Насчёт плохих новостей, есть локальная плохая новость, но с ней российские иллюмино-пользователи и так знакомы, я полагаю.

Это более производительная разновидность optical mapping.

Недостаток - может использоваться только с никазами. Преимущество - может картировать геном человека за сутки, причём в автоматическом режиме. Испытывали китайцы (BGI), которые в 2010 году были первыми покупателями менее производительной системы оптического картирования Argus.

генсек давай не отвлекатся от темы

Первый китайский секвенатор (BGI-1000) обещают представить во втором квартале этого года:
https://www.genomeweb.com/business-news/bgi...technology-year
Wang declined to disclose whether BGISEQ-1000 would be one of the platforms it commercializes this year. He did say that one platform would be a large-scale platform "more accurate than anything you can imagine," while the other would be a desktop instrument with automated sample prep. He said Reid would provide details of the systems in the second quarter.

Новость (локальная) интересная (в плане прогноза развития) и в связи с ней вопрос. Кто бы ни был следующим, все равно на него ляжет роль расширения рынка. А тут еще девальвация. Так, вот интересно: на сколько государство готово в настоящее время и в настоящих валютных условиях поддерживать NGS-пользователей?

Главное, не оказаться вообще без представительства. Что, на мой взгляд, в нынешних условиях весьма вероятно. Тогда останется только контрабанда и долгая-долгая спячка всех хай- и ми- секов. Вот будет радость для эплайдовцев. Ровно до тех пор пока и они не решат вообще выйти из нашей страны вследствие идущей ко дну экономики и, соответственно, мизерного рынка...

Так что эта локальная новость очень поганая....

Но надо и понимать, что мало какого производителя будет устраивать пара десятков пользователей с 1-2-мя заказами в год (в среднем).

Знаете, я продолжаю наблюдать за ситуацией, и она развивается очень интересно. Пока выглядит скорее хорошо, чем плохо. Show must go on!

Собственно, вот: http://www.biovitrum.ru/press-center/all_n...ritorii_rossii/

А дальше посмотрим, учтут ли они ошибки предшественников. Есть такое впечатление, что учтут.

Будем надеется, что их дипломатия в ведении НГС бизнеса окажется достаточно гибкой, коли уж сумели увязать в своем партнерстве всех трех производителей

http://www.biovitrum.ru/product/kletochnay...iotek_dlya_ngs/

Ну спецы быстро тренеруются, а потом в ИЛС и так текучка
Другой вопрос, как увеличить число пользователей. Ведь это вопрос не рекламы, а гос. финансирования. Каким бы спец не был совершенным, если не будет выдано еще 50 мегагрантов под приобретение никакой успешный маркетинг не поможет... Эплайду и Рошу хорошо, у них есть иной интерес к рынку в России кроме секвенаторов, а у Иллюмины, одни "иллюминаторы" Так что Иллюмине +/- пара десятков вяло-текущих пользователей в России это как бы их 0.000.... -й процент прибыли

Есть мнение, что эти ребята иллюмину и сманили. Теперь даже понятно, куда именно.

Illumina Launches MiSeq FGx for Forensic Applications:

https://www.genomeweb.com/business-news/ill...ic-applications

а что кстати с одномолекулярным в Зелике? Там получился этот проект, никто не знает?

... снаряды рвутся все ближе и ближе.
Впрочем, СТРов хватит на мой век. Со временем все по нишам распределтся: 25 СТР-ов, 250-500 СНП-ов или же ... лишь бы не было войны.

http://www.completegenomics.com/technology/
Это, часом, не та самая технология?

Она самая. Но обещают удивить длиной секвенирования. Наверное тот же секвенатор (с наноболлами) плюс аналог иллюминовских или кайджиновских трифосфатов.

g. REPLI-g- and ThruPLEX-FD-based protocols seem to be adequate solutions for exome sequencing of low input samples.

Примерно 8 лет назад говорил я тебе, что это - сумасшедшие методы, их полезно держать в арсенале, а ты ... коктейлы, коктейлы (биасы).
Так что, возвращайся к Труплексу своему.

Ну что - вышла статья в Методах Природы - как сделать МНОГО дешёвых библиотек для РНКа-сека.
1. Выделяем, рушим и ремонтируем РНКу (ДНКу можно не убирать).
2. Лигируем адапторы - А+(Баркод 6-8 букв)+кусок Иллюмины или Торрента.
Проблема адапторов - адапторы дорогие, но 1 пробирки хватает примерно на 20 тысяч библиотек - примерно 1-3 цента на одну библиотеку.
3. Смешиваем всё в 1 кучку и убираем у кучки рРНКу.
4. 1 реакция РТ на этой кучке.
5. Почти такое же как №2 лигирование.
ПЦР, БиоА на всей кучке.
Можно смешать 8-32 образцов в каждую кучку - потом сделать 5-11 кучек и повесить индекс Иллюмины - вот и 40-350 библиотек легко сделать ручками.
Полного текста нет у самого - там много ссылок и в сипплиментах данных.
Где нужен метод - всякие скрины, нокауты, нокдауны, препараты.
Нужно для отличной библиотеки 1-10нг на лунку.

Метод проверен на примерно 20 статьях - байясы почти все разобраны в статье. Цена на библиотеку около 2-3 баксов со всеми бусами.
В статье на dUTP было взято 20 или 40 РАЗ больше РНКи, так как dUTP данные очень старые.

Продублирую на другую ветку.

Simultaneous generation of many RNA-seq libraries in a single reaction.
http://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/n...nmeth.3313.html
Although RNA-seq is a powerful tool, the considerable time and cost associated with library construction has limited its utilization for various applications. RNAtag-Seq, an approach to generate multiple RNA-seq libraries in a single reaction, lowers time and cost per sample, and it produces data on prokaryotic and eukaryotic samples that are comparable to those generated by traditional strand-specific RNA-seq approaches.

Ну вот, другое дело.

Гекнсек, у вас замечательный обзор, но мне все хочется спросить - куда вы его хотите пристроить? Или это для себя, вроде фана ?

Да там много сомнительных вещей, и чего особенно много -- личного мнения автора. Только для себя и сгодится.

Who is it?

Тел.+7 (499) 550 15 25 с этого сайта,
http://www.albiogen.ru/
если кому интересно.

Сегодня пришло:

Мероприятия по NGS
http://www.biohab.ru/index.php?/topic/1034...приятия-по-ngs/

Ситуация с ИЛС
http://www.biohab.ru/index.php?/topic/69-illumina-в-россии/

Кстати, об ИЛС:
http://www.interlabservice.ru/about/news/?id=10270

Интересная новость на днях пришла из Китая. Там появился секвенатор NextSeq CN500 - китайский клон Иллюминовского NextSeq 500:
http://investor.illumina.com/mobile.view?c...&d=1&id=2030982
http://www.chinamoneynetwork.com/2015/04/0...-series-b-round
Похоже, производство этих приборов они наладили, причём с помощью Illumina, заинтересованной в расширении рынка сбыта для своих расходных реагентов.