Может вопрос покажется банальным, но...
Проводить измерения углеводных компонентов на поверхности лимфоцитов (с помощью ФИТЦ-меченых лектинов) есть возможность только в соседнем городе.
Можно набирать материал (цельную кровь) и передавать при температуре +4, но при этом время хранения может удлиниться до суток.
Второй вариант - выделение лимфоцитов и замораживание. Например по такому методу:40 мЛ Ханкьс Буфферед Салине Солутион (ХБСС) - Ца+2, -Мг+2
20 мЛ ДМСО
40 мЛ фетал цалф серум
100 мЛ
Какой вариант выбрать? Если первый, то, возможно ли давление еще каких либо стабилизирующих агентов? Если второй, то какие потери клеток при этом могут быть?

Думается, что лучше передать цельную кровь, пусть через сутки, чем замороженные лимфоциты. Жизнеспособность однозначно будет выше...

угу - ну например "оксидатив бурст" на нейтрофилах у вас сдохнет через 6 часов на цельной крови - может "многоцветным иммунотайперам виднее" ?

что - начинаюсчий иммунотайпер ? - фиксируй формалином - на скорость не влияет

поконкретней задачку-то опишите что нужно то ?

очисть фиколом -отмой- фиксани формалином - отдай клиентам - если лажанутся -
исчи других "парнеров" без извинений типа "бла-бла-бла"

Разве автор говорил про необходимость детекции ROS???
Или может быть вы ROS определять будете на замороженных нейтрофилах?

Спасибо за ответы!
Я поняла, что предпочтительней не замораживать.
Может в цельную кровь добавить, например, HEPES? Насколько я знаю, его рекомендуют для клеточных культур.
А по поводу, выделения лимфоцитов на фиколе, потом фиксация, потом что? Все-таки замораживание? Или можно при +4?

Погодите, давайте по порядку. Сначала подробнее расскажите, что конкретно вы хотите определять, какая методика предполагаемая.
Может быть и такой вариант, как выделение МПК, их фиксация параформальдегидом, хранение при +2-8. Но она не всегда подходит. Поэтому сразу расскажите подробно, что вы хотите получить.

Планируем смотреть гликозилированность: степень сиалированности (т.е. наличие сиаловых кислот в составе углеводной части белков на поверхности клеток крови), фукозилированность и т.д.
Т.е. основной инструмент исследования - лектины, меченные ФИТЦ. Материал - кровь больных острым и хроническим миелоидным лейкозом. Мы можем набирать материал на разных этапах лечения. Хорошо было бы все-таки как-то коллекционировать материал, поскольку, когда поступит больной предсказать сложно. Вообщем-то определенные зависимости есть. Например, много поступивших перед Новым Годом. Это отступление от темы...
Если бы проточник был под рукой, то процедура следующая:
1. Лизис эритроцитов;
2. Промывка ЗФР;
3. Фиксация: к осадку добавляем 8% параформальдегид - 7 мин. инкубации при темп. комн.
4. Промывка ЗФР;
5. Добавляем лектин, меченый ФИТЦ.
Обязательно проверяем пропидиумом иодидом, поскольку лектину цитотоксичны, если неправильно подобрать концентрацию. По лиетратурным данным его нужно 125 мг в образец. Но в этом я не уверена. Все надо проверять...
Спасибо за внимание к нашей проблеме!!!

Дык,(3)-клетки фиксированные. Можете хранить итранспортировать на +4 в течение,как минимум, нескольких дней. 8%PF-не многовато?

А (4)-(5)- делаете уже на месте, перед анализом.

Собственно да. Попробуйте 4% параформ на DPBS. Выделили клетки, отмыли хорошенько, если нужно - долизировали эритроциты. Зафиксировали, закрыли плотненько пробирки и везите в другой город. А там уже добавляйте свои лектины и непосредственно перед учетом - PI.

однозначно надо оптимизировать процедуру "на месте". Фиксация запросто может убить гликозилирование и лектин не будет связываться. Я бы сначала попробовал красить лектином и потом фиксировать - это с наибольшей вероятностью будет работать. Это все в сравнении со свежими живыми лейкоцитами т.е. покрасить -> посмотреть -> фиксировать -> посмотреть. Потом попробывать подержать кровь сутки в виде цельной крови на ЭДТА и покрасить, в виде мононуклеаров в РПМИ и покрасить. И уж самый ненадежный вариант - это сначала фиксировать и потом красить. Даже если вы что-то увидите, то у вас все результаты будут гулять в зависимости от того как там все зафиксировалось, какой свежести альдегид, сколько он стоял при комнатной темп, как вы от него отмылись или заблокировали его.

Фиксированным клеткам добавлять PI относительно бессмысленно, покрасится все кроме эритроцитов. Разве что для того, чтоб от эритроцитов при анализе окончательно отстроиться.

Не путай фиксированные (если были интактны- то и останутся интактны) и пермеаибилизированные. А равно же- пропидий с аннексиномV

ты хочешь сказать, что живые клетки после фиксации 4% формальдегидом не покрасятся PI (600 Да) ?

я тебе даже больше скажу, они даже антителами (150 000 Да) на внутриклеточные антигены покрасятся, только хуже чем после пермиабилизации!

ЗЫ: интактные - означает "не тронутые", формальдегид совсем клетки не трогает

Не факт.
Правда, я не работаю сболее чем 1-2% PF, и вообще предпочитаю анализировать все сразу.

фиксция хорошим, без примеси метанола, параформальдегидом не нарушает проницаемости клеточной мембраны. Поэтому не покрасятся интактные клетки PI.
Если красятся, то посмотрите при каких G крутите и какой реально процент PF и какой pH. Перефиксированные клетки будут легче биться при крутке. Неправильно приготовленный PF (гретый больше чем на 56) будет агрессивнее и больше аутофлюоресценция.

PI или 7-AAD использовать обязательно для исключения поврежденных клеток.

фиксацию лучше проводить 1% PF на холоду, но полчаса.

вариант лектины сначала, фиксация потом кажется предпочтительным. Разумеется на холоду. В крайнем случае охлаждаем до 4, потом “греем“ до 12-16 (реально пробирки просто не во льду, а в штативе надо льдом, сантиметр-полтора, висят). Если сначала охладить, а потом подогреть, то интернализации не будет, а связывание может быть лучше чем при 4. А если просто охладить с 37 до 10 то интернализация и прочие бяки могут еще идти.

Фиксированные клетки в PF хранить нельзя. Надо отмыть и в PBS. Но отмыть только один раз и при отборе супера не усердствовать. В пробирке останется “чуть-чуть“ PF. Этого достаточно.

Оптимальный вариант это сравнить сначала на месте, рядом с цитометром, свежий материал и 3-х, скажем, суточный.

Спасибо, я все поняла. Буду следовать вашим советам. Особенно касаемых фиксации. А концентрация PI (125 мг в образец) не большевата? Это опять же из источников литературы. Может ее тоже уменьшить?

Прошу прощения, 125 микрограмма!

очень много, достаточно нескольких микрограмм

Вот нашла от 2-5 микрограмм. Спасибо!

Поскольку у меня в статье в сборник, что прилагался к Школе 2011 вкрался недосмотр (или опечатка), то предпочитаю повторить по косточкам.

Высокая наука в лице
Critical aspects in analysis of cellular DNA content.
Darzynkiewicz Z.
Curr Protoc Cytom. 2010 Apr;Chapter 7:Unit7.2. Review

говорит, что:

Given the above, there is nearly 100-fold
excess of the ligand per binding site when 10¨6
cells are stained in 1 ml volume at 100 μM
dye concentration.

иными словами, для PI, чья молмасса 668.3946
получаем совершеннно нереальную цифру.

поэтому в высокую науку верим, но красим “старым казачьим способом“ : 10 миКРОграмм/мл

не поленюсь, попробую в ближайшее время. В деталях не помню как проверял, но точно помню однозначный вывод, который я для себя сделал. Возможен еще такой вариант, что если красить не очень долго, то бывшие живыми до фиксации покрасятся, но слабее, чем дохлые из-за меньшего размера дыр в мембране.

это правильно



а вот это зря
Окрашивание PI-ем клеток бывших до фиксации с нескомпрометированной мембраной это артефакт. Тут и пробовать нечего. А вот на качество параформальдегида стоит обратить внимание. Пригодится в других экспериментах.