Проблема уже обсуждалась, однако в контексте экспрессии белка в E-coli. Меня же интересуют возможные причины отсутствия белка при экспрессии в эукариотах. Кратко: взяли бактериальный ген, поставили под минимальный CMV промотор и пытаемся экспрессировать в линии HEK-293. Ранее получили рекомбинант, а на него антитела. Теперь ставим с клеточного лизита блот, чтобы обнаружить белок, но его там нет. К слову, мРНК есть, плазмида имеет все необходимое для экспрессии в эукариотах. И еще, пробуем разные варианты гена, как с шопероном так и без......результат все тот же. Если кто сталкивался с проблемой экспрессии чужеродного белка в эукариотах поделитесь своими наблюдениями..Заранее всем благодарна!

1) Положительный контроль на блоте был?
Например, лизат с рекомбинантным белком
2) Попробуйте покрасить гистологически клетки.
3) Попробуйте иммуноафинку сделать с клеточным лизатом. Или хотя бы иммуно преципитацию.

И вообще проблема распадается на две: Кривой блот и кривая экспрессия. При чем предоставленных вами данных абсолютно не хватает для какого-либо анализа.

ну а полученные антитела на этот белок работают вообще? а кодоны в кДНк бактериальные?
сделайте фьюз с GFP, можно будет глазами видеть есть ли белок после трансфекции. Если ваш белок весь деградирует, то он по идее и GFP утащит в протеасому, ну а если будет затыке в синтезе самого белка изза кодонов например, то клетки будет зеленые, а на вестерне увидите тока gfp продукты недосинтеза. ну это так навскидку идеи.

Антитела первичные работают точно. Проверено на рекомбинанте - он же положительный контроль нашего белка. Кроме того ставили тубулин на предмет плохого блота - все ok. Рекомбинант примешивали в колийный лизат, тоже все хорошо видно. С вторых антител белка до 0,5 нгр видит. в кДНК у нас конечно бактериальные кодоны, потому что нам именно это то и интересно, менять на эукариотические просто не по задаче. Фьюжн с GFP недавно получили и кстати увидели, что GFP локализации не меняет, остается в цитозоле на 24 часа. (к вопросу о протеасомах). Очень интересен вопрос о недосинтезе...например, будут ли АТ работать на недосинтезированном белке?
И еще раз про цели и задачи: взяли произвольный бактериальный ген, да и решили экспрессировать его эукариотической машиной. Сначала в колях наплодили плазмиду с нужной вставкой (по 100 раз все сиквенсом проверяли) потом переклонировали в плазмиду с регулируемой экспрессией. С нее в одну сторону читаем GFP, в другую - наш ген. В колях наполучали рекомбинантный белок и путем иммунизации наполучали поликлонов к белку. А теперь пытаемся блотом словить наш белок в культуре HEK293 и ничего не ловим вообще. ВОТ ТАК

так у вас все-таки фьюз или gfp и ваш белок "читаются в разные стороны"????

будут ли работать антитела -зависит от того к какому они эпитопу белка и есть ли он в недосинтезированном белке.
Если есть фьюз- то покрасьте на Вестерне антителами к GFP

--будут ли АТ работать на недосинтезированном белке?

Если поликлоны, белок большой, а недосинтез небольшой. То скорее да, чем нет. Если белок маленький и недосинтез большой могут отказаться работать и поликлоны. Почему? - Написал ship.

Не хотите повысить чувствительность? Пометить белок С14 АК и потом сделать иммунопреципитацию. Или сначала иммуноафинка,а потом блот с ECL.

И еще можно попробовать бесклеточный лизат на предмет синтеза проверить, но это уже совсем забава.

У нас есть плазмида с разнонаправленным чтением...в одну сторону GFP в другую - интересующий нас ген. Так мы трансфекцию контролим... А что касается фьюжн-белка - то это другая плазмида, в которой GFP слит с нашим белком. Это для контроля локализации. Разные плазмиды. А вот покрасить GFP на вестерне можно, но а смысл....только если удостовериться, что блот в порядке, а вообще его в микроскоп видно....полыхает зелёным. Кстати, а что такое безклеточный лизат???

--Кстати, а что такое безклеточный лизат???
Это когда все клетки лизируют однако рибосомки остаются добавляют коктейль из tРНК и матрицу, которую можно в другой прокариотической системе получить. Ну и аминокислотки,частично меченные.

--А что касается фьюжн-белка - то это другая плазмида, в которой GFP слит с нашим белком.

Во-во он то синтезируется? Попробуйте покрасить этот белок антителами к GFP и вашими антителами? Посмотреть что получится.

зеленым то полыхает, только в случае фьюза на вестерене вы увидите либо просто GFP, например, если дальше затык синтеза изза кодонов, или полноразмерный фьюз если все ок, если чтото промежуточное если идет развал или недосинтез.

Да спасибо) Хорошая мысль...надо попробовать