Уважаемые коллеги!

поделитесь, пожалуйста, опытом
сколько может сохраняться РНК, если ткань гомогенизировать в буфере с гуанидином (по Хомчински)?
РНК нужна для ОТ-ПЦР

P.S.: про RNA Later я в курсе

А хранить то как потом собираетесь? при комнатной Т? на -20? на -80?

Под спиртом при -80 у меня хранилась 10 лет и была хорошего качества. Можно в растворе при -80 желательно с ингибитором, тоже годами.

В сушильном шкафу можно недолго хранить... Вопрос ст***во - сколько весит килограмм гвоздсй, если у телеги отвалилась подкова.

Цветочек случайно добавил,
RNALater, если вы в курсе, нужен не для сохранения выделенной РНК, а для сохранения РНК в ткани до ее выделения. Сохраняете ткань. Поэтому, как правильно заметил предыдущий оратор, вопрос и прозвучал как "Что делать дядьке в Киеве, если в огороде растет бузина". Для сохранения РНК важно не то, в каком буфере вы будете гомогенизировать, а то как хранилась ткань до выделения. Если в ткани РНКу вы уже похерили, то никакой "Хомчински" или др. вам не помогут.
Хранение РНК стандарт: -80, расвор с ингибитором, или под спиртом, перевозить можно под изопропанолом, даже при комнатной температуре, но не долго. В лиофилизированном виде не пробовал, но говорят можно, правда лучше, наверно, использовать какие-нибудь спец фильтры (не знаю).

Хранил супернатант гомогената из раздавленных в тризоле мух перед ОТ-ПЦР до 2 месяцев при -20С. Цикл разгорания реакции для таких проб не смещался при сравнении со свежими вариантами.

РНК не сохраняется в буфере с гуанидином, долго, при комнатной температуре или ниже. Лучше сразу выделять и РНК осаждать в этаноле.
Замораживание гематогена на -20...-80С, в принципе, позволяет сохранить РНК на долго.
Вы сами можете посмотреть, что с РНК после такого хранения. Разные ткани ведут себя по разному.
RNALater, тоже не панацея. Опять, важна какая ткань и как она пропитывается насыщенным раствором сульфатом аммония.

спасибо за ответ
ткань до погружения в тризол будет из свежего насекомого. человек, который будет мне ее передавать максимум сто может, так это порезать ма-а-алекнького насекомца ножницами и сделать гомогенат
как показала практика, сульфат аммония и rna later проникают внутрь плохо. соответственно и с РНК беда
поэтому и возник вопрос, нельзя ли сунуть в тризол до выделения

Все протоколы по хранению ТКАНЕЙ для последующего выделения РНК нужно ликвидировать. А выделенную РНК рекомендую хранить ПОД СПИРТОМ при -70-80 оС. Это если надо хранить надолго...
А при повседневной работе - в холодильнике (4-8 оС), но в присутствии избытка ингибитора РНК-аз. 0,5-1,0 ед. на мкл. В течении нескольких недель с РНК никаких проблем . Ингибитор работает до замораживания и в неспиртовой среде.
пы.сы: полезно иногда проводить поиск в форуме по теме...

У Вас нет РНК.

Чистая РНК прекрасно хранится в 1хТЕ, рН 7.0 в любых условиях, в том числе и при комнатной температуре, если не лазить перчатками или пальцами в пробирку.
РНК растворяют при +55...+65 С, в течение 20-30 минут в 1хТЕ и без всяких ингибиторов РНКаз.
Можно полностью инактивировать РНКазы в растворе 10мМ DTT при растворении РНК при +55 С.

РНК хорошо сохраняется в осадке после осаждения из раствора LiCl (равный объем 10М LiCl к раствору РНК в 1хТЕ).

Обычно, весь ажиотаж, о нестабильности РНК берёт своё начало давно, когда всего боялись и неаккуратно работали. Никаких РНК ингибиторов и прочего не нужно, даже при синтезе кДНК.
Работать с РНК как с ДНК. Пробирки чистые, и кончики тоже, всё остальное - надуманно.

РНК будет разрушаться в ткани, которую держат в растворе с гуанидином, но это не связано с активностью РНКаз. Даже на -20 С, РНК постепенно разрушается в лиз-растворе.

Если нет возможности выделить сразу РНК, то ткань лучше измельчить с в растворе с 4М гуанидинтиоционатом, и быстро доставить куда вам нужно. Но РНК будет постепенно деградировать.

господа! не нужна мне выделенная РНК! вернее, нужна, конечно, но как с ней работать и хранить я прекрасно знаю
мне нужен метод сохранения ткани, не через сульфат аммония. чтобы можно было извлечь РНК через месяц

ну конечно. ее нет. повалилась
а если сразу выделить и не хранить в RNA later - то есть
вопрос, в чем хранить кусок ткани?

Можно засунуть в жидкий азот.
А можно еще во что-нибудь пожиже и на самое дно

благодарю за ответы

--Чистая РНК прекрасно хранится в 1хТЕ, рН 7.0 в любых условиях, в том числе и при комнатной температуре, если не лазить перчатками или пальцами в пробирку.
РНК растворяют при +55...+65 С, в течение 20-30 минут в 1хТЕ и без всяких ингибиторов РНКаз.


УРЯЯЯААА!!! А как узнать, что она достаточно чистая, что бы все эти утверждения были справедливы.

--РНК будет разрушаться в ткани, которую держат в растворе с гуанидином, но это не связано с активностью РНКаз.

Ну откройте же скорее нам секрет - с чем же это связано?

--господа! не нужна мне выделенная РНК! вернее, нужна, конечно, но как с ней работать и хранить я прекрасно знаю
мне нужен метод сохранения ткани, не через сульфат аммония. чтобы можно было извлечь РНК через месяц

Вариант первый: сушить лиофильно можно, и не лиофильно(просто в вакууме над скажем Р2О5), ибо потом вы все равно все тризолом убьете. Потом запаять стеклянную ампулу. Или опять же, как ниже описано, хранить с осушителем.

Вариант второй: Несколько проводок в абсолютном спирте(сушка магнием или натрием), до так сказать полного обезвоживания. Потом под спиртом хранить в герметичной таре, если запаять в стекле(осторожно нужно умение это делать иначе сгорите нафиг), то можно и так. А если в каком-нибудь фалконе или эппендорфе с винтом, то лучше положить в другую герметичную тару и засыпать силикагелем(прокаленном градусах при 120-140)

Морозить при этом ничего не надо. Нет воды - нет гидролиза.

Вариант первый: сушить лиофильно можно, и не лиофильно(просто в вакууме над скажем Р2О5), ибо потом вы все равно все тризолом убьете. Потом запаять стеклянную ампулу. Или опять же, как ниже описано, хранить с осушителем.

Вариант второй: Несколько проводок в абсолютном спирте(сушка магнием или натрием), до так сказать полного обезвоживания. Потом под спиртом хранить в герметичной таре, если запаять в стекле(осторожно нужно умение это делать иначе сгорите нафиг), то можно и так. А если в каком-нибудь фалконе или эппендорфе с винтом, то лучше положить в другую герметичную тару и засыпать силикагелем(прокаленном градусах при 120-140)

Морозить при этом ничего не надо. Нет воды - нет гидролиза.
[/quote]

спасибо
все это замечательно, но в почти полевых условиях никак нереализуемо...

--все это замечательно, но в почти полевых условиях никак нереализуемо...

Еще как реализуемо. Если хотите, могу помочь я в Питере.

Нету у Вас РНК, это ошметки ДНК. Когда насекомое резали - ДНК на куски построгалась. Так теперь ошметками и выделяется.

ДНК же длинная, метров 8, резали-резали и порезали. Лучше коров растите и руду плавьте, не нужна Вам биология и наука не нужна.

Вот и буренка пожаловала. Скажи-ка - мууу. Когда грамоте научат - можно будет сена подбросить. Сено-солома, Алексей Толстой.

я смотрю, у отдельных личностей потрясающее чувство юмора... из серии сам шучу, сам смеюсь

Миллионы маршируют и гогочут. По каждому пункту проверяйте и доказывайте. Разве не длинна ДНК насекомых? Многометрова и запросто рвется-режется. Киты портятся, с РНК не умеют работать, ДНК уже порезана. Жидкий азот, больше идей пока нет по сказанному тексту.

Это у Волкова очередной климактерический припадок.

Ага. Попробуйте в лабе несколько вариантов и сравните. Иначе не имеет смысл насекомых мучить. Этап называется отработкой методик и может занимать месяцы и при вариациях биоматериала даже годы. Это опыт, собственный, который просто так не приобретается и порой на словах не передается. Нельзя полностью имитировать все условия, должно быть некое чувство, которому так просто не научить. Вот так. ИМХО, у Вас даже ДНК нет. По моему скромному и малоопытному мнению.

Скажите, пожалуйста, а как именно DTT инактивирует РНКазы? Без шуток, очень интересно.

Я думаю, что RNK намного умнее чем Вы думаете (инактивировал РНК-азы добавляя ДТТ ). Ессно, он имел ввиду, что Ингибиторы РНК-аз эффективно работают исключительно в среде ДТТ, стандартно 10 мМ, который выступаут в роли протектора, притом что самой Ревертазе наплевать на ДТТ - реакция идет замечательно и без него.
Так что любопытство Ваше неуместно.

вы ошибаетесь, с ДНК как раз все в порядке. а РНК валится.
а методики отрабатываются, и даже оптимизируются.
а исходный вопрос был о том, был ли у кого положительный опыт

почитайте этот патент:

http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?...RS=PN/6,825,340

для инактивации РНКаз необходимо -S-S- связи перевести в -SH HS- с помощью DTT при нагревании от 37 до 65 градусов.

Достаточно 10-20 мМ DTT в растворе с РНК, прогреть до 55 градусов, и все РНКазы инактивируются.




может вам попробовать живыми насекомые доставить с поля. Лиофилизация ткани и заливка насекомых тризолом не поможет сохранить РНК.

к сожалению, это невозможно

Тогда на пенсию идите или в бизнес, хоть деньги или спокойствие будут. Или замуж и детей рожайте десяток на освоение Сибири.

Если сульфат аммония плохо проникает в ткани, то и гуанидинтиоционат, тоже не станет пропитывать эту ткань.
Надо насекомое раздавить в 4М гуанидинтиоционате, и измельчить насколько это возможно. В этом случае, ткань будут пропитываться солью. Надо пробовать.
Может стоит попробовать заспиртовать насекомое. Как это делают при подготовки к срезам (укус и пропанол).

С ДТТ этот фокус по патенту у меня в свое время не прошел. Видимо не все РНК-зы этому подвержены. Но с ингибитором+ДТТ - по несколько месяцев в холодильнике с РНК ничего не случилось...

Имитация бурной деятельности в рабочее время. Домой идите лучше и не мешайте другим работать.

странно - народ из парафиновых архивных трупофф рнку достает

Это всё в Питере, где зимой холодно и темно, специалистов нет и реально можно годами из пробирки в пробирку сжатый воздух переливать. На нищенском пособии для престарелых и духовно убогих российских учоных.

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%...al.pone.0021043

Итальянская статья в плосе, наскоро сварганенная на раковых клетках, про возможность фиксировать клетки формальдегидом. Читать учитесь.

http://replicarolexwatches.simpsite.nl/
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches
https://pastebin.pl/view/ab0e458a
https://mix.com/watcheshutukcom
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html
https://share.naturalnews.com/posts/3904099
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8
https://flipboard.com/@replicarolex24
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch

I can’t imagine focusing long enough to research; much less write this kind of article. You’ve outdone yourself with this material. This is great content.
파워볼사이트

Thank you so much for the post you do. I like your post and all you share with us is up to date and quite informative, i would like to bookmark the page so i can come here again to read you, as you have done a wonderful job.
꽁머니

Thank you so much for the post you do. I like your post and all you share with us is up to date and quite informative, i would like to bookmark the page so i can come here again to read you, as you have done a wonderful job.
mersin feribot

I really like your take on the issue. I now have a clear idea on what this matter is all about..
안전놀이터

I am very enjoyed for this blog. Its an informative topic. It help me very much to solve some problems. Its opportunity are so fantastic and working style so speedy.
rb88.casino

I enjoy every single posts, I actually appreciated, I would personally adore extra information and facts because of this, mainly because its fairly pleasing., Have fun here ideal for allowing.
สล็อต pp

Excellent website! I adore how it is easy on my eyes it is. I am questioning how I might be notified whenever a new post has been made. Looking for more new updates. Have a great day!
Canadian Visa Online

Nice post! This is a very nice blog that I will definitively come back to more times this year! Thanks for informative post.
sonoline b

Positive site, where did u come up with the information on this posting?I have read a few of the articles on your website now, and I really like your style. Thanks a million and please keep up the effective work.
Sell Nordstrom Gift Card In Nigeria

This is a brilliant blog! I'm very happy with the comments!..
bidvaluable is a one-stop for women's clothes

Wow, this is fascinating reading. I am glad I found this and got to read it. Great job on this content. I liked it a lot. Thanks for the great and unique info.
go to page