Полная версия страницы  English  

DNAse без RNAse активности

Pages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
AlexanderLopbio, 18.02.2013 21:33
Здравствуйте!
Посоветуйте пожалуйста DNAse с минимальной (без нее) RNAse активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей rtPCR.
Спасибо.
-Ъ-, 18.02.2013 23:57
Дело в том, что все эти ДНК-азы RNA-ase free имеют свойство одинаково плохо инактивироваться. Поэтому придется выбрать метод выделения чистой РНК, свободной от ДНК. Производят их кому не лень. Если еще вдобавок отфенолить "продукт реакции", будет круто.
Prefix, 19.02.2013 11:19
Отдельные ДНК-азы всегда вызывают кучу проблем. Если хотите действительно хорошее выделение РНК для ОТ-ПЦР, используйте готовые киты BioMaxi RNAPurification Kit (Biomatrica) или PaxGene Qiagen. BioMaxi подешевле и включает качественную ДНК-азу.
-Ъ-, 19.02.2013 12:44
У Роша тоже хороший препарат... был раньше, когда он поглощал Бёрингер. Может ещё ничего.
https://www.roche-applied-science.com/custo...50410#DNase%20I
AlexanderLopbio, 19.02.2013 13:53
Большое спасибо за советы. Пока у меня в наличии только Fermentas* DNase I, RNase-free и киты
PureLink® RNA Mini Kit (Ambion®). Попробую с ними.
У меня еще пара вопросов появилась. Можно ли считать, что в mQ воде нет RNAse, либо необходима DEPC обработка в любом случае? У какого производителя в Москве посоветуете заказывать праймеры и пробы?
Спасибо!
xenopus, 19.02.2013 14:02
(AlexanderLopbio @ 19.02.2013 11:53)
Можно ли считать, что в mQ воде нет RNAse?

Можно, нету.
Но это не значит, что РНКаз нет на руках, сэмплерах, эппах и проч...
AlexanderLopbio, 19.02.2013 14:17
Спасибо!
kloun, 20.02.2013 10:19
А чем TurboDNAse плоха? Мы её активно используем. Очень хорошо работает и очень быстро.
-Ъ-, 20.02.2013 13:57
(kloun @ 20.02.2013 11:19)
Ссылка на исходное сообщение  А чем TurboDNAse плоха? Мы её активно используем. Очень хорошо работает и очень быстро.

http://www.protocol-online.org/biology-for...osts/23806.html
Guest, 28.02.2013 11:18
(Prefix @ 19.02.2013 11:19)
Ссылка на исходное сообщение 
  Если хотите действительно хорошее выделение РНК для ОТ-ПЦР, используйте готовые киты BioMaxi RNAPurification Kit (Biomatrica)  или PaxGene Qiagen. BioMaxi подешевле и включает качественную ДНК-азу.
- судя по названию кита, BioMaxi предназначается для выделения РНК из крови. Или этот кит может использоваться и для других источников?
ASDF, 28.02.2013 11:38
Ъ , если что то у кого то где то не работает, это не значит, что продукт плохой.
ДназаТурбо реально мощная, но на колонке если просто РНК клеанАп делать не чистится. Ее обязательно прогреть надо. Если прогревать РНК не хочется (с добавлением ЭДТА конечно) к Турбе прилагается специальная смола.

ПурЛинк должен достаточно чисто выделять. Можно добавить один степ и ДНазить прямо на колонке во время выделения. Ваша Дназа ферментас вполне подойдет.
ship, 28.02.2013 11:47
RNasy kit + on-column treatment with RNAse free DNAse set от QIAGEN.
все отлично работает, ДНКазой быстро и удобно обрабатывать тк на колонке все делается.
-Ъ-, 28.02.2013 12:44
(ASDF @ 28.02.2013 12:38)
Ссылка на исходное сообщение  Ъ , если что то у кого то где то не работает, это не значит, что продукт плохой.
ДназаТурбо реально мощная, но на колонке если просто РНК клеанАп делать не  чистится. Ее обязательно прогреть надо.  Если прогревать РНК не хочется (с добавлением ЭДТА конечно) к Турбе прилагается специальная смола.   

ПурЛинк должен достаточно чисто выделять. Можно добавить один степ и ДНазить прямо на колонке во время выделения. Ваша Дназа ферментас вполне подойдет.

Дыма без огня не бывает. Моё дело - показать, что с ДНКзой надо работать "с пониманием".
http://www.protocol-online.org/forums/topi...nase-treatment/
А что за смола прилагается к Турбе?
-Ъ-, 28.02.2013 12:53
(-Ъ- @ 28.02.2013 13:44)
Ссылка на исходное сообщение  Дыма без огня не бывает. Моё дело - показать, что с ДНКзой надо работать "с пониманием".
http://www.protocol-online.org/forums/topi...nase-treatment/
А что за смола прилагается к Турбе?

For removing gDNA from a previously isolated RNA sample, the TURBO DNA-free™ kit provides an efficient solution. This kit combines the highly active TURBO DNase™ I enzyme and a novel reagent: TURBO DNA-free™ DNase Removal Reagent. This reagent removes the TURBO DNase™ I and divalent cations rapidly and effectively, eliminating the need to heat-inactivate the enzyme, which can lead to strand scission of the RNA. TURBO DNA-free™ DNase Removal Reagent also helps to reduce protein contamination and removes the need to use phenol:chloroform extraction, which can reduce the RNA yield from limiting samples.
Guest, 28.02.2013 12:59
(-Ъ- @ 28.02.2013 12:53)
Ссылка на исходное сообщение  For removing gDNA from a previously isolated RNA sample, the TURBO DNA-free™ kit provides an efficient solution.
-все так, и фермент отлично работает, но оговаривается, что даже небольшие следы этой инактивирующей смолы ингибируют последующие реакции.
-Ъ-, 28.02.2013 13:14
(Guest @ 28.02.2013 13:59)
Ссылка на исходное сообщение  -все так, и фермент отлично работает, но оговаривается, что даже небольшие следы этой инактивирующей смолы ингибируют последующие реакции.

Про смолу вроде все понятно если она также удаляет из среды другие белки и двухзарядные катионы - может напрочь ингибировать последующие реакции...
ASDF, 28.02.2013 13:43
Ъ, Да все нормально со смолой ))). она нормально откручивается и плотно сидит. Никаких проблем не доставляет.

но ваш природный скепсис мне даже импонирует, сам иногда такой ..
ASDF, 28.02.2013 13:46
(ship @ 28.02.2013 12:47)
Ссылка на исходное сообщение  RNasy kit + on-column treatment with RNAse free DNAse set от QIAGEN.
все отлично работает, ДНКазой быстро и удобно обрабатывать тк на колонке все делается.



Принципиальная проблема этой связки - невозможно сделать на QIAcube. А куб это единственная причина, по которой стОит использовать дорогущий Киаген.
-Ъ-, 28.02.2013 15:06
(ASDF @ 28.02.2013 14:43)
Ссылка на исходное сообщение  Ъ, Да все нормально со смолой ))). она нормально откручивается и плотно сидит. Никаких проблем не доставляет.

но ваш природный скепсис мне даже импонирует, сам иногда такой ..

Дело в том, что я эту смолу 15 лет использую в своих китах для выделелния НК на финальной стадии элюции с сорбента. Ambion нагло своровал идею. smile.gif под видом инактивации ДНКазы. Но мне не жалко. wink.gif
А клонированную Турбо ДНКзу видимо дешевле производить, чем нативную очищать от следов РНКаз.
abdula, 28.02.2013 21:59
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР.
Спасибо.


вообщем деградация рнка - если делаете експрессию реал-таймом - на скорость не влияет - обратная транскрипция 15-мерами и суперскриптом-3 и вперед
abdula, 28.02.2013 22:02
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР.
Спасибо.


вас должно напрягать натуральная деградация рнк ин виво , а не после выделения - да хоть рнказой обрабатуйте smile.gif
abdula, 28.02.2013 22:18
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР.
Спасибо.


если праймеры на соседних екзонах - зачем днказа ?
abdula, 28.02.2013 22:39
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР.
Спасибо.


кстати ваш вопрос достаточно абстрактен - конкретно что хотите рт-пцрить ?
ато может вы там на гептитах-ц или спидах балуетесь smile.gif
abdula, 28.02.2013 22:47
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР.
Спасибо.


обратитесь к фрау зеленски - она у нас тут болший спец по диагностике рнка-вирусов - типа спида - топик три строчки вниз smile.gif
abdula, 28.02.2013 23:08
(abdula @ 28.02.2013 23:47)
Ссылка на исходное сообщение  обратитесь к фрау зеленски - она у нас тут болший спец по диагностике рнка-вирусов - типа спида - топик три строчки вниз smile.gif

http://molbiol.ru/forums/index.php?showuser=350
kloun, 02.03.2013 21:45
Закрыла фрау Зелёнка ветку для гостей - пусть сами там у себя на северах и паряться, если работать не умеют или учили их плохо . Вот ответ по её гелю:

Пиццу развозить - не камильфо - пусть ваши начальники-индусы идут развозитьsmile.gif

Что можно сказать по гелю:

Почему на такой выдержке такой слабый маркёр - или его мало или он разваливается.

Не вижу праймеров на геле - они все выработались или их там не было, или они спрятались в облаке снизу?

Вот интересно - что за хвост тянется из геля - это или геномка или тонны кДНКи - которая нарабатывается с одного рабочего праймера. Её много - что может убивать ПЦР само по себе - титруются праймеры и на образования продукта их уже не хватает.

Отсутствие множества полос может говорить о том - что Тм ПЦРа высоковата - тогда один праймер просто не садится.

Ну и контрольную РНКу нужно ставить в реакцию - это тут сказали.
nigoal123, 27.05.2022 06:57
The first sentence has nigoal one single purpose ลิงค์รับทรัพย์ to entice the reader to sexy gaming Write in a semi-informal dream gaming read the next sentence. ka gaming rewarding to satisfy curiosity.

it sets the tone for 123goal the rest of the article 11hilo hooking the reader in 123bets choose the best three or four. pggame123 one step at a time. big gaming are intrigued by a question
nigoal123, 28.05.2022 09:14
Many a time you have nigoal seen some writers or ลิงค์รับทรัพย์ people write their problems sexy gaming Write in a semi-informal dream gaming and suggestions in ka gaming some newspapers

They are writing their 123goal opinions and beliefs 11hilo in the form of an article. 123bets choose the best three or four. pggame123 we will get ourselves familiar big gaming with article writing
guest: 123 , 02.06.2022 12:17
For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.
guest: 123 , 02.06.2022 12:18
For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.
123goal 123goal, 10.06.2022 13:51
You need to work on yourself if 123GOAL you are lacking inner confidence. This takes 11hilo time, but the rewards are worth it. Every สล็อต 123 time you think pggame123 negatively about yourself, counter that thought big gaming with a positive one, or when you feel 123dic a negative thought coming on – list three 11 ไฮโล things that you are appreciativeslotxo of. Believe in yourself. Make it maintaining a long ambslot part of your morning routine to compliment yourself when you slotonline see your reflection in the mirror. The more confident you are, the more likely you will feel comfortable showing other people the real you!
123goal 123goal, 11.06.2022 12:14
When you are developing a 123GOAL solid content strategy, you want 11hilo to create สล็อต 123 different types pggame123 of content that big gaming catches users 123dic at the right 11 ไฮโล step of the sales funnel. From creating slotxo top-of-the-funnel content to end-of-the-funnel content, you will find that certain ambslot types of content will create potential slotonline customers that you can lead through the sales funnel.
123goal 123goal, 13.06.2022 10:12
What is the goal 123GOAL of your content? You should สล็อต 123 always be driving your audience to pggame123 a next step – whether that’s viewing another บาคาร่าออนไลน์ blog post, signing up for a newsletter, or sharing the 11 ไฮโล content. Good content is actionable เกมสล็อต because it asks the person 123dic viewing it to do something. Every big gaming piece of content you produce should provide a clear, actionablect855 next step. To make your 123bets content actionable.
123goal 123goal, 14.06.2022 10:57
Negative emotions 123GOAL are unpleasant สล็อต 123 and disruptive pggame123 emotional บาคาร่าออนไลน์ reactions. Examples of 11 ไฮโล negative เกมสล็อต emotions include 123dic sadness, fear, big gaming anger, or jealousy. These ct855 feelings aren't just unpleasant; they also make it hard to function in your normal daily life and 123bets interfere with your ability to accomplish goals.
123goal 123goal, 15.06.2022 11:54
If you have nigoal passion in life and you ลิงค์รับทรัพย์ can see a career path that lets sexy gaming you tap into it then, dream gaming by all means, attack! But don’t tell ka gaming others they need your life. If you 123GOAL don’t feel a clear passion in your life then work to become as good as สล็อต 123 you can be in the thing pggame123 you’re doing. And don’t listen to บาคาร่าออนไลน์ anybody yelling at you for not conforming 11 ไฮโล to their ‘non-conformist’ ideals.
123goal 123goal, 16.06.2022 10:10
Lifestyle, however, is only part of the nigoal happiness equation. Your attitude ลิงค์รับทรัพย์ about life sexy gaming and the things dream gaming that happen to you each day ka gaming can also greatly impact your 123GOAL overall level of happiness and life สล็อต 123 satisfaction. It’s probably no secret pggame123 that optimists tend to be happier people, but you บาคาร่าออนไลน์ may not realize that there’s more to optimism than "putting on a happy face" or "looking on the bright side." There are specific traits that bring optimists 11 ไฮโล more success, greater health, and increased life satisfaction.
123goal 123goal, 17.06.2022 12:33
Car buying is confusing by nigoal design. Manufacturers, marketing companies, ลิงค์รับทรัพย์ dealers, even your friends and sexy gaming family - everybody has an agenda, and dream gaming it is not their job to ensure ka gaming that you make the best choice. They do want you to be happy with the product they 123GOAL sell you, but no one is going สล็อต 123 to stop you from making a mistake - if this mistake serves them. But there is pggame123 hope. If you understand what they want, and most importantly what you want - your chances of making a good choice บาคาร่าออนไลน์ and enjoying your new 11 ไฮโล car are pretty good.
123goal 123goal, 20.06.2022 08:58
Whether you’re planning to sell nigoal moisturizers, masks, ลิงค์รับทรัพย์ exfoliators, or skin-tightening sexy gaming products, you’ll dream gaming always have ka gaming a market among 123GOAL consumers who want to look their สล็อต 123 best and boost their pggame123 confidence. Plus, with many people looking to บาคาร่าออนไลน์ build their self-esteem after months of spending 11 ไฮโล time indoors, now is a great time to learn how to start your own skincare line.
123goal 123goal, 21.06.2022 06:55
It is impossible to work successfully on a nigoal continuing basis with people who ลิงค์รับทรัพย์ are strangers. That applies both to people with sexy gaming in your organisation dream gaming and to people outside your organisation. For example as an accountant ka gaming you may need to work alongside a solicitor 123GOAL from your client's law firm with สล็อต 123 whom you have never worked before. Quite apart from discussing the facts of your mutual client's case, as soon as you start dealing with that solicitor pggame123 you will be evaluating what kind of person he or she is. To serve the client successfully you need to build up a relationship บาคาร่าออนไลน์ of trust and mutual respect with that solicitor. Obviously you also need a relationship of trust and mutual 11 ไฮโล respect with your client.
123goal 123goal, 22.06.2022 08:29
Being funny attracts people because it creates nigoal123 a comfortable atmosphere dreamgaming to relax and release sexy gaming negative energy. This is why ลิงค์รับทรัพย์ people who are prettygaming funny generally 123GOAL seem to have more สล็อต 123 friends than not. It is now a pggame123 proven fact that laughter is indeed the best medicine. Okay, maybe not the best because it can’t cure cancer บาคาร่าออนไลน์ laughter lifts your mood and relieves 11 ไฮโล stress and in so doing makes your immune system stronger and reduces pain.
123goal 123goal, 23.06.2022 08:49
Human sleep patterns follow nigoal123 natural circadian rhythms. Your circadian dreamgaming rhythms are sexy gaming like internal ลิงค์รับทรัพย์ clocks affecting prettygaming the way you สล็อต 123 think, feel, and behave throughout 123GOAL the day. Circadian rhythms are based on the lightness or pggame123 darkness of your environment. When your brain perceives darkness outside, your body begins to release a บาคาร่าออนไลน์ hormone called melatonin. Melatonin makes 11 ไฮโล you drowsy and prepares your body for sleep.
123goal 123goal, 29.06.2022 08:54
Acne is one of the most common nigoal123 skin conditions in the world, dreamgaming affecting an estimated 85 percent sexy gaming of young adults Trusted ลิงค์รับทรัพย์ Source. Conventional prettygaming acne treatments, 123GOAL like salicylic acid, สล็อต 123 niacinamide, or benzoyl slotonline peroxide, are proven to be the most 11 ไฮโล effective acne solutions, but they 123dic can be expensive and have undesirable side effects, such as dryness, redness, and irritation.
123goal 123goal, 05.07.2022 05:41
You already know there are many nigoal123 great reasons to exercise—from dreamgaming improving energy, sexy gaming mood, ลิงค์รับทรัพย์ sleep, and health to prettygaming reducing anxiety, 123GOAL stress, and depression. And สล็อต 123 detailed exercise instructions slotonline and workout plans are 11 ไฮโล just a click away. But if knowing how and why to exercise was enough, we’d all be in shape. Making 123dic exercise a habit takes more—you need the right mindset and a smart approach.
123goal 123goal, 06.07.2022 06:35
Legumes like beans and nigoal123 lentils are packed with magnesium. One dreamgaming cup of , ambslot cooked ลิงค์รับทรัพย์ lentils has about 71 milligrams prettygaming of magnesium, 123GOAL and a cup of สล็อต 123 cooked black beans slotonline has almost double that with 120 milligrams. Plus, they’re high in fiber, and studies 11 ไฮโล show that high-fiber foods can help ease menstrual cramps as well as help control 123dic your blood sugar and lower levels of “bad” LDL cholesterol.
123goal 123goal, 08.07.2022 11:18
It’s really important to nigoal123 have self-esteem — we hear that a lot, dreamgaming and we might believe it, but ambslot that doesn’t ลิงค์รับทรัพย์ mean it’s easy to do. Sometimes prettygaming when we try to believe in 123GOAL ourselves, dark clouds สล็อต 123 of doubt or even self-loathing gather. Sure, it’s possible to fake confidence, slotonline but what is the trick to building genuine self-esteem? Right now, right here, your true 11 ไฮโล nature is wonderful, pure, and perfect. 123dic This is true regardless of what kind of person you are.
123goal 123goal, 09.07.2022 10:07
Most people obsess over how nigoal123 to be successful because we dreamgaming all want to feel like we matter. Without ambslot achieving any success, we might ลิงค์รับทรัพย์ look back on our prettygaming life disappointed by our lack 123GOAL of impact on the world. สล็อต 123 Striving to achieve a slotonline greater purpose is what keeps us fighting to survive and grow. The goal of achieving success 11 ไฮโล will help you live a more purposeful life 123dic by pushing you to overcome obstacles, work a bit harder and pursue happiness.
123goal 123goal, 11.07.2022 11:20
Of the many nigoal123 forms of content dreamgaming marketing, social media is big gaming one that is often treated alone ลิงค์รับทรัพย์ because it follows a prettygaming slightly different set of 123GOAL rules. Unlike other digital เกมสล็อต marketing content listed above, สล็อต 123 social media marketing is all about pggame123 getting people to look AND respond directly. You want 11 ไฮโล engagement that is palpable.
123goal 123goal, 12.07.2022 09:36
You may not associate nigoal123 washing your dreamgaming hands, eating big gaming your vegetables, ลิงค์รับทรัพย์ or watching your prettygaming weight as key 123GOAL steps toward better เกมสล็อต eyesight, but they all play a role. Living a สล็อต 123 healthier lifestyle and protecting pggame123 your eyes from the sun and foreign objects can’t protect against every eye condition. But 11 ไฮโล they can all lower your odds of developing a problem that could hurt your vision.
123goal 123goal, 13.07.2022 11:42
Eating a healthful diet rich in nigoal123 nutrients is dreamgaming important for the big gaming body as a whole, ลิงค์รับทรัพย์ and it may also prettygaming benefit the skin. Eating a diet rich in various plant 123GOAL foods and เกมสล็อต lean protein sources สล็อต 123 may help provide the nutrients pggame123 that the skin needs to 11 ไฮโล stay healthy. People looking to keep their skin clear may also want to cut out specific troublesome foods.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.