Полная версия страницы  English  

RAPD праймеры

Pages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13
The problem, 06.03.2013 09:09
Обладает ли кто инфо по структурам праймеров для RAPD бактериальных геномов, принципы выбора, возможные структуры, ссылки для поиска
RNK, 06.03.2013 09:42
Мы можете сгенерировать 12-мерные случайные праймеры в программе FastPCR, то есть вначале сгенерировать случайную ДНК, а потом подобрать на ней 12-мерные случайные праймеры. Можно подобрать праймеры длиннее 12 оснований. Я могу вам выслать такие праймеры.

Другой вариант, это взять известный вам геном, например, ваши бактерии, и сделать анализ коротких последовательностей на частоту встречаемости. И использовать наиболее часто встречаемые последовательности как праймеры. Лучше использовать праймеры длиной в 12 оснований и выше. GC состав 50-60%, и без димеров. Это тоже очень просто сделать.

Затем просто надо проверить эти праймеры уже на практике, интересные или не интересные праймеры получились.
-Ъ-, 06.03.2013 10:05
3. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 18, 6531-6535, 1990.
4. Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprint genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res., 18, 7213-7218.

История РАПД-ПЦР начиналась с них. Также что-то изображал в это же время Булат Сергей в Гатчине.
Неплохой обзор:
http://www.ipmd.ir/papers/random%20amplifi...polymorphic.pdf
Из личного опыта: праймеры могут быть любые! Но основное требование - отрицательный контроль должен быть чистым, без полос, при самых низких температурах отжига.
Успеха! Вот уж не ожидал что такой вопрос зададите. confused.gif Вы же кажется дифдисплеем занимались. confused.gif
The problem, 06.03.2013 10:29
да, но дифф-дисплей а) был давно б) не предполагал рандома в) это была кДНК
-Ъ-, 06.03.2013 10:41
Простым РАПДом заниматься будет намного легче. Но все зависит от цели.
Одни и те же праймеры могут подходить к разным геномам, но, ессно, паттернами должны отличаться.
Как ни станно, требования к качеству ДНК высокие - сильно порванная ДНК имеет свои картинки по сравнению с высокомолекулярной.
The problem, 06.03.2013 10:48
идеологически так себе метод, особенно по нынешним временам
-Ъ-, 06.03.2013 10:48
(The problem @ 06.03.2013 11:29)
Ссылка на исходное сообщение  да, но дифф-дисплей а) был давно б) не предполагал рандома в) это была кДНК

РАПД приспособили к кДНК.
Welsh and McClelland, M. Fingerprinting using arbitrarily primed PCR: applications to genetic mapping, population biology, epidemiology and detection of differentially expressed RNAs. In: Mullis, K.B., Ferre, F. and Gibbs, R.A.
(eds.) The Polymerase Chain Reaction. pp. 295-303. Brikhauser, Boston, 1994.
Guest, 06.03.2013 15:33
Не надо трогать рапд. Вообще. Не надо даже думать о нём smile.gif
RNK, 06.03.2013 16:42
RAPD отличный метод, но надо уметь его правильно использовать и подобрать "правильные" праймеры, а не те праймеры, что обычно используют с первоисточника 1990 года.

Очень много полезного, чего можно сделать с помощью правильных RAPD праймеров.

Думаю, что метод RAPD будет поднят на новый уровень в будущем.
-Ъ-, 06.03.2013 17:46
(Guest @ 06.03.2013 16:33)
Ссылка на исходное сообщение  Не надо трогать рапд. Вообще. Не надо даже думать о нём  smile.gif

Это почему же? В очумелых ручках очень даже ничего метод... Мы же не знаем что у The problem за идея родилась в голове.
-Ъ-, 06.03.2013 17:51
(RNK @ 06.03.2013 17:42)
Ссылка на исходное сообщение  RAPD отличный метод, но надо уметь его правильно использовать и подобрать "правильные" праймеры, а не те праймеры, что обычно используют с первоисточника 1990 года.

Очень много полезного, чего можно сделать с помощью правильных RAPD праймеров.

Думаю, что метод RAPD будет поднят на новый уровень в будущем.

Например. confused.gif
Мне лично никакие патерны из статей не удавалось воспроизвести - 90 % полос исчезало, как правило. weep.gif
The problem, 06.03.2013 18:23
спасибо, буду думать. Точнее, попробую, если удасться себя убедить, что по крайней мере можно сказать, что 2 штамма суть разные штаммы, то тогда и о сиквенсе можно подумать, а если будет казаться, что либо одинаковые, либо же что ответ неочевиден, тогда ...снова подумать
ipanchev, 06.03.2013 18:47
емнип в конце 90-ых у фармации был сет rapd праймеров для бактерий. но кажется он позлволял различать виды а не штаммы.
по-моему стоит попробовать стандартный набор праймеров - operon или carl roth.
rapd капризен к качеству и количеству днк в реакции. очень часто невозможно возпроизвести результат на другом аппарате.
также если различия между штаммами обязаны точковым мутациям, то вряд ли Вы увидите разницу исползуя rapd
-Ъ-, 06.03.2013 18:51
Можно воспользоваться, конечно, этим китом
http://ru-ru.invitrogen.com/site/ru/ru/hom...phism-AFLP.html
но, все-таки, правильно начать с РАПДа с выбором рандом-праймеров без всякой системы (не серийные).
RNK, 06.03.2013 19:04
(-Ъ- @ 06.03.2013 16:51)
Ссылка на исходное сообщение  Например. confused.gif
Мне лично никакие патерны из статей не удавалось воспроизвести - 90 % полос исчезало, как правило. weep.gif


RAPD в основном для личного пользования, как получаются результаты у конкретного человека с конкретными праймеры, так он с этим идет дальше. В других лабораториях вероятно будут картинки выглядить иначе, разные люди и условия реакции - приборы, полимераза и качество ДНК.

Но можно ведь найти такие праймеры которые не будут так варьировать между лабораториями, и лучшие полимеразы использовать.
Но это всё технические детали по самому RAPD методу.

Можно "поднять" данный метод на другой уровень, и не зацикливаться на том что уже известно.
Я не могу сказать, что конкретно будет сделано, но идея ПЦР со случайным праймером близка к идеи амплификации целого генома, и даже ДНК одной клетки.
Здесь есть хитрости с праймером/ами и полимеразами и последовательностью некоторых этапов.
Можно ведь выявить полиморфизм между отдельными клетками! Но надо знать как, не прибегая к секвенированию.
Это я имел в виду, под новым уровнем использования RAPD.
The problem, 06.03.2013 23:28
все, что Вы сказали- только интенция, а методически непонятно.
RNK, 07.03.2013 12:20
Это проект в разработке и я не могу особо распространяться в деталях. Цель проекта, выявление полиморфизма на уровне одной клетки, не прибегая к геномному секвенированию, без гибридизации сравниваемых геномных ДНК и прочего.

То есть изначально количество ДНК только одного ядра, и надо таким образом размножить эту ДНК, чтобы можно было одновременно выявить различия (качественные и количественные) между индивидуальными клетками.

Конечно, принцип метода RAPD здесь некоторым образом используется.
-Ъ-, 07.03.2013 13:25
На фоне вала NGS публикаций РАПДом только распугаете грантодателей.
Актуальность сравнительных исследований двух соседних клеток по полиморфизму геномов и количеству ДНК - большой вопрос. confused.gif
Но в то же время можно, конечно, выбрать модель для сравнений...
Но на РАПДе на одной клетке да с одним праймером далеко не уедешь. no.gif
Лучше попробуйте сначала RCA для получения "массы материала", а потом делайте что хотите РАПД-ом с целой панелью-серией из 96 праймеров.
RCA кстати можно делать в режиме реал-тайм (для количественной оценки), и далее поставив целиком плашку с 96 праймерами можно получить инфо о каком-то полиморфизме... Вот и весь проект навскидку.
Nett, 07.03.2013 13:32
RNK, на ограниченном количестве материала - как Вы можете быть уверены в стабильной повторяемости результатов на одном образце? Неужели настолько мало данных о геномовиде/частоте мутаций, чтобы испльзовать RAPD? Если не ошибаюсь, минимум три-пять независимых повтора опыта надо сделать.
Имхо, ошибки прямого секвенирования выйдут в меньшую "погрешность"
Если вопрос в финансах - это другое дело.
-Ъ-, 07.03.2013 14:04
The problem, рекомендую этот 13-членный праймер для сравнения двух бакт. геномов:
5-cgagctccacatt-3, Там шпилек никаких, есть один сильный димер, но не начинающий реакцию (3-конец болтается), зато будет защищен от неспецифического отжига. Можно изменить в сторону укорочения.
По Бласту не пробивал.
The problem, 07.03.2013 16:15
а почему именно этот? по какому принципу?
RNK, 07.03.2013 16:29
(-Ъ- @ 07.03.2013 12:25)
Ссылка на исходное сообщение  На фоне вала NGS публикаций РАПДом только распугаете грантодателей.
Актуальность сравнительных исследований двух соседних клеток по полиморфизму геномов и количеству ДНК - большой вопрос. confused.gif 



я не имел в виду использовать RAPD метод на анализа ДНК одной клетки, RAPD вообще не упоминается, так как сейчас актуальна пропаганда NGS как наиболее эффективного метода, для всего что пожелаешь.

NGS это очередной подход перевода бюджетных денег в западные корпорации, да и зарплата сотрудникам не нужна, роботы всё сделают.

Задача нашего проекта в другом, и совсем не обязательно секвенировать каждую клетку по отдельности, чтобы сделать какие-то вселенские выводы.
Можно гораздо проще и дешевле решать сложные задачи.
RNK, 07.03.2013 16:38
(Nett @ 07.03.2013 12:32)
Ссылка на исходное сообщение  RNK, на ограниченном количестве материала - как Вы можете быть уверены в стабильной повторяемости результатов на одном образце? Неужели настолько мало данных о геномовиде/частоте мутаций, чтобы испльзовать RAPD? Если не ошибаюсь, минимум три-пять независимых повтора опыта надо сделать.
Имхо, ошибки прямого  секвенирования выйдут в меньшую "погрешность"
Если вопрос в финансах - это другое дело.


Мутации наблюдаются в любой стареющий клетке, и мутации это умирание клетки. Что тут детектировать! Мутации не ценны сами по себе. Клетка умерла и собрала с собой все свои индивидуальные мутации, в новое поколении это не переходит.
Вообще, зацикленность на мутациях, как основной источник болезней и здоровья, это ущербный путь. Всё на самом-то деле, как раз и наоборот.
У стариков столько всяких неожиданных мутаций по всей ядерной и митохондриальной ДНК и в каждой клетке можно наблюдать, и что из этого следует. Да ничего.

Другое дело рекомбинации в половых клетках, которые уже наследуются.
Но здесь мейоз активно подчищает "разрушения" ДНК.
Guest, 07.03.2013 17:19
Для любого метода просто надо найти уместное применение. Если Вы хотите получить стабильный, хорошо воспроизводящийся паттерн, то Ваш выбор, что-нибудь типа AFLP.
Если хотите сравнить популяции по разнообразию или выявить в популяции клонов измененные варианты - RAPD вполне подойдет. Только надо помнить, что метод весьма чувствителен ко всему - к типу полимеразы, к температурному профилю ПЦР, к стартовой концентрации ДНК. Ну и конечно то, что даже в редакционной политике некоторых уважаемых журналов ясно написано - RAPD не принимаем...
А так, если берете группу штаммов в одной амплификации для определенных задач - до сих пор весьма эффективное решение.
-Ъ-, 07.03.2013 19:43
(The problem @ 07.03.2013 17:15)
Ссылка на исходное сообщение  а почему именно этот? по какому принципу?

Ожидаемый вопрос. Но никаких умных ответов - без принципа, с потолка.
https://www.google.ru/url?sa=t&rct=j&q=&esr...4,d.bGE&cad=rjt
Метод получения максимально большого количества неспецифических полос! lol.gif
-Ъ-, 07.03.2013 19:45
(RNK @ 07.03.2013 17:29)
Ссылка на исходное сообщение  я не имел в виду использовать RAPD метод на анализа ДНК одной клетки, RAPD вообще не упоминается, так как сейчас актуальна пропаганда NGS как наиболее  эффективного метода, для всего что пожелаешь.

NGS это очередной подход перевода бюджетных денег в западные корпорации, да и зарплата сотрудникам не нужна, роботы всё сделают.

Задача нашего проекта в другом, и совсем не обязательно секвенировать каждую клетку по отдельности, чтобы сделать какие-то вселенские выводы.
Можно гораздо проще и дешевле решать сложные задачи.

Я во многом солидарен с Вами. beer.gif
abdula, 07.03.2013 21:27
(The problem @ 06.03.2013 10:09)
Ссылка на исходное сообщение  Обладает ли кто инфо по структурам праймеров для РАПД бактериальных геномов, принципы выбора, возможные структуры, ссылки для поиска


зачем вам рапд на бактериях если сто геномов изолятов сиквинируются за один день smile.gif
abdula, 07.03.2013 21:30
(The problem @ 06.03.2013 10:09)
Ссылка на исходное сообщение  Обладает ли кто инфо по структурам праймеров для РАПД бактериальных геномов, принципы выбора, возможные структуры, ссылки для поиска


бактериев сейчас сравнивают на уровне геномофф а не рапдофф smile.gif
abdula, 07.03.2013 21:39
(The problem @ 06.03.2013 10:09)
Ссылка на исходное сообщение  Обладает ли кто инфо по структурам праймеров для RAPD бактериальных геномов, принципы выбора, возможные структуры, ссылки для поиска

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3378690/
RNK, 08.03.2013 00:55
(-Ъ- @ 07.03.2013 18:45)
Ссылка на исходное сообщение  Я во многом солидарен с Вами. beer.gif



Monday 26th June 2000 will be remembered as the day when humankind learned, in a sense, what it is to be human. You might be forgiven for thinking something momentous has happened. You may even remember for me rest of your life what you were doing when the news reached you.
Certainly, some important people thought something important had happened.

Bill Clinton said, "This is the most wondrous map ever produced by mankind."

Tony Blair called it, "a breakthrough that opens the way for massive advancement in the treatment of cancer and hereditary diseases, and that is only the beginning."

So what in fact had happened? The leaders of the publicly sponsored Human Genome Project (HGP) and Craig Venter who leads the parallel private initiative of the company Celera Genomics chose that day to announce that they had completed the first working draft of the complete set of human genetic information, the human genome.

Furthermore, with some 3.1 billion base pairs in the genome even when the whole genome has been sequenced to that accuracy, there could remain some 310,000 errors, and these in only a 'generic' genome of the few who contributed their DNA to the sample. There remain too the genetic differences between human individuals. These are important if Tony Blair's prediction for disease treatment is to be realised. These differences, most of which are accounted for by 'single nucleotide polymorphisms' (SNPs), are also receiving intensive research and with the extraordinary acceleration of the project through mechanisation combined with computing power, sequencing the genomes of individuals may be only a few years off.

However, I believe that placing so much hope for the future of medicine on knowing the human or the individual's genome is a big mistake. Tony Blair hopes that it will advance the treatment of cancer. But a recent study of medical records of 44,788 pairs of twins born in Sweden, Denmark and Finland since 1870 concluded that overall, if one identical twin had cancer, his or her sibling had a less than 10% chance of contracting the same disease.
Clearly, this statistic alone shows that knowing genomes is not going to solve the cancer problem for most people. Incidentally, the authors concluded from this finding that environmental factors are of overwhelming importance in the aetiology of cancer, but in the light of comments in the previous paragraph that would be too simple a conclusion.

Mapping and sequencing the human genome will lead to the identification of more genes causing Mendelian disorders and to the diagnostic and predictive tests for them. But most of the human bodily form and function cannot be accounted for in terms of Mendelian inheritance, that is, the linking up of characteristics or traits which geneticists call phenotypes, abstracted from the totality of the organism, with associated inheritable markers called genotypes.
.....
nigoal123, 27.05.2022 06:57
The first sentence has nigoal one single purpose ลิงค์รับทรัพย์ to entice the reader to sexy gaming Write in a semi-informal dream gaming read the next sentence. ka gaming rewarding to satisfy curiosity.

it sets the tone for 123goal the rest of the article 11hilo hooking the reader in 123bets choose the best three or four. pggame123 one step at a time. big gaming are intrigued by a question
guest: 123 , 02.06.2022 12:19
For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.
123goal 123goal, 10.06.2022 14:08
You need to work on yourself if 123GOAL you are lacking inner confidence. This takes 11hilo time, but the rewards are worth it. Every สล็อต 123 time you think pggame123 negatively about yourself, counter that thought big gaming with a positive one, or when you feel 123dic a negative thought coming on – list three 11 ไฮโล things that you are appreciativeslotxo of. Believe in yourself. Make it maintaining a long ambslot part of your morning routine to compliment yourself when you slotonline see your reflection in the mirror. The more confident you are, the more likely you will feel comfortable showing other people the real you!
123goal 123goal, 13.06.2022 09:58
What is the goal 123GOAL of your content? You should สล็อต 123 always be driving your audience to pggame123 a next step – whether that’s viewing another บาคาร่าออนไลน์ blog post, signing up for a newsletter, or sharing the 11 ไฮโล content. Good content is actionable เกมสล็อต because it asks the person 123dic viewing it to do something. Every big gaming piece of content you produce should provide a clear, actionablect855 next step. To make your 123bets content actionable.
123goal 123goal, 14.06.2022 10:45
Negative emotions 123GOAL are unpleasant สล็อต 123 and disruptive pggame123 emotional บาคาร่าออนไลน์ reactions. Examples of 11 ไฮโล negative เกมสล็อต emotions include 123dic sadness, fear, big gaming anger, or jealousy. These ct855 feelings aren't just unpleasant; they also make it hard to function in your normal daily life and 123bets interfere with your ability to accomplish goals.
123goal 123goal, 15.06.2022 12:07
If you have nigoal passion in life and you ลิงค์รับทรัพย์ can see a career path that lets sexy gaming you tap into it then, dream gaming by all means, attack! But don’t tell ka gaming others they need your life. If you 123GOAL don’t feel a clear passion in your life then work to become as good as สล็อต 123 you can be in the thing pggame123 you’re doing. And don’t listen to บาคาร่าออนไลน์ anybody yelling at you for not conforming 11 ไฮโล to their ‘non-conformist’ ideals.
123goal 123goal, 16.06.2022 10:29
Lifestyle, however, is only part of the nigoal happiness equation. Your attitude ลิงค์รับทรัพย์ about life sexy gaming and the things dream gaming that happen to you each day ka gaming can also greatly impact your 123GOAL overall level of happiness and life สล็อต 123 satisfaction. It’s probably no secret pggame123 that optimists tend to be happier people, but you บาคาร่าออนไลน์ may not realize that there’s more to optimism than "putting on a happy face" or "looking on the bright side." There are specific traits that bring optimists 11 ไฮโล more success, greater health, and increased life satisfaction.
123goal 123goal, 17.06.2022 12:35
Car buying is confusing by nigoal design. Manufacturers, marketing companies, ลิงค์รับทรัพย์ dealers, even your friends and sexy gaming family - everybody has an agenda, and dream gaming it is not their job to ensure ka gaming that you make the best choice. They do want you to be happy with the product they 123GOAL sell you, but no one is going สล็อต 123 to stop you from making a mistake - if this mistake serves them. But there is pggame123 hope. If you understand what they want, and most importantly what you want - your chances of making a good choice บาคาร่าออนไลน์ and enjoying your new 11 ไฮโล car are pretty good.
123goal 123goal, 20.06.2022 08:32
Whether you’re planning to sell nigoal moisturizers, masks, ลิงค์รับทรัพย์ exfoliators, or skin-tightening sexy gaming products, you’ll dream gaming always have ka gaming a market among 123GOAL consumers who want to look their สล็อต 123 best and boost their pggame123 confidence. Plus, with many people looking to บาคาร่าออนไลน์ build their self-esteem after months of spending 11 ไฮโล time indoors, now is a great time to learn how to start your own skincare line.
123goal 123goal, 21.06.2022 06:57
It is impossible to work successfully on a nigoal continuing basis with people who ลิงค์รับทรัพย์ are strangers. That applies both to people with sexy gaming in your organisation dream gaming and to people outside your organisation. For example as an accountant ka gaming you may need to work alongside a solicitor 123GOAL from your client's law firm with สล็อต 123 whom you have never worked before. Quite apart from discussing the facts of your mutual client's case, as soon as you start dealing with that solicitor pggame123 you will be evaluating what kind of person he or she is. To serve the client successfully you need to build up a relationship บาคาร่าออนไลน์ of trust and mutual respect with that solicitor. Obviously you also need a relationship of trust and mutual 11 ไฮโล respect with your client.
123goal 123goal, 22.06.2022 08:31
Being funny attracts people because it creates nigoal123 a comfortable atmosphere dreamgaming to relax and release sexy gaming negative energy. This is why ลิงค์รับทรัพย์ people who are prettygaming funny generally 123GOAL seem to have more สล็อต 123 friends than not. It is now a pggame123 proven fact that laughter is indeed the best medicine. Okay, maybe not the best because it can’t cure cancer บาคาร่าออนไลน์ laughter lifts your mood and relieves 11 ไฮโล stress and in so doing makes your immune system stronger and reduces pain.
123goal 123goal, 23.06.2022 08:54
Human sleep patterns follow nigoal123 natural circadian rhythms. Your circadian dreamgaming rhythms are sexy gaming like internal ลิงค์รับทรัพย์ clocks affecting prettygaming the way you สล็อต 123 think, feel, and behave throughout 123GOAL the day. Circadian rhythms are based on the lightness or pggame123 darkness of your environment. When your brain perceives darkness outside, your body begins to release a บาคาร่าออนไลน์ hormone called melatonin. Melatonin makes 11 ไฮโล you drowsy and prepares your body for sleep.
123goal 123goal, 29.06.2022 08:45
Acne is one of the most common nigoal123 skin conditions in the world, dreamgaming affecting an estimated 85 percent sexy gaming of young adults Trusted ลิงค์รับทรัพย์ Source. Conventional prettygaming acne treatments, 123GOAL like salicylic acid, สล็อต 123 niacinamide, or benzoyl slotonline peroxide, are proven to be the most 11 ไฮโล effective acne solutions, but they 123dic can be expensive and have undesirable side effects, such as dryness, redness, and irritation.
123goal 123goal, 05.07.2022 05:28
You already know there are many nigoal123 great reasons to exercise—from dreamgaming improving energy, sexy gaming mood, ลิงค์รับทรัพย์ sleep, and health to prettygaming reducing anxiety, 123GOAL stress, and depression. And สล็อต 123 detailed exercise instructions slotonline and workout plans are 11 ไฮโล just a click away. But if knowing how and why to exercise was enough, we’d all be in shape. Making 123dic exercise a habit takes more—you need the right mindset and a smart approach.
123goal 123goal, 06.07.2022 06:09
Legumes like beans and nigoal123 lentils are packed with magnesium. One dreamgaming cup of , ambslot cooked ลิงค์รับทรัพย์ lentils has about 71 milligrams prettygaming of magnesium, 123GOAL and a cup of สล็อต 123 cooked black beans slotonline has almost double that with 120 milligrams. Plus, they’re high in fiber, and studies 11 ไฮโล show that high-fiber foods can help ease menstrual cramps as well as help control 123dic your blood sugar and lower levels of “bad” LDL cholesterol.
123goal 123goal, 08.07.2022 11:30
It’s really important to nigoal123 have self-esteem — we hear that a lot, dreamgaming and we might believe it, but ambslot that doesn’t ลิงค์รับทรัพย์ mean it’s easy to do. Sometimes prettygaming when we try to believe in 123GOAL ourselves, dark clouds สล็อต 123 of doubt or even self-loathing gather. Sure, it’s possible to fake confidence, slotonline but what is the trick to building genuine self-esteem? Right now, right here, your true 11 ไฮโล nature is wonderful, pure, and perfect. 123dic This is true regardless of what kind of person you are.
123goal 123goal, 09.07.2022 10:03
Most people obsess over how nigoal123 to be successful because we dreamgaming all want to feel like we matter. Without ambslot achieving any success, we might ลิงค์รับทรัพย์ look back on our prettygaming life disappointed by our lack 123GOAL of impact on the world. สล็อต 123 Striving to achieve a slotonline greater purpose is what keeps us fighting to survive and grow. The goal of achieving success 11 ไฮโล will help you live a more purposeful life 123dic by pushing you to overcome obstacles, work a bit harder and pursue happiness.
123goal 123goal, 11.07.2022 11:03
Of the many nigoal123 forms of content dreamgaming marketing, social media is big gaming one that is often treated alone ลิงค์รับทรัพย์ because it follows a prettygaming slightly different set of 123GOAL rules. Unlike other digital เกมสล็อต marketing content listed above, สล็อต 123 social media marketing is all about pggame123 getting people to look AND respond directly. You want 11 ไฮโล engagement that is palpable.
123goal 123goal, 12.07.2022 09:23
You may not associate nigoal123 washing your dreamgaming hands, eating big gaming your vegetables, ลิงค์รับทรัพย์ or watching your prettygaming weight as key 123GOAL steps toward better เกมสล็อต eyesight, but they all play a role. Living a สล็อต 123 healthier lifestyle and protecting pggame123 your eyes from the sun and foreign objects can’t protect against every eye condition. But 11 ไฮโล they can all lower your odds of developing a problem that could hurt your vision.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.