Full Version of the page  Russian  

Куда уходят бэнды?

Soulmate, 19.12.2014 18:33
Проблема затяжная.
Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент.
В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов.
В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно.
Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений.
грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений
грешили на праймеры - заказали новые - ничего.
грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего
меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше.
концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело.
Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!!
Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье)))
Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом?
ПАМАГИТЯ!!!


Attached image(s)
Attached Imageihaveaproblem.jpg
ihaveaproblem.jpg — (103.33)   

MMM, 19.12.2014 19:21
Судя по картинке вы кладете много тоталки - разбавьте матрицу
-Ъ-, 19.12.2014 21:30
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33)
Link to the original post  
грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений

Что поменяли? confused.gif Название есть у "компонентов"? Характеристики?
Очевидно, что надо спрашивать у продавца компонентов чего он нахимичил.
В (-) тоже шмеры?
-Ъ-, 19.12.2014 21:31
(MMM @ 19.12.2014 20:21)
Link to the original post  Судя по картинке вы кладете много тоталки - разбавьте матрицу

Не все так просто в РАПДе, Маниатис. tongue.gif
yorik, 20.12.2014 21:39
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33)
Link to the original post  Проблема затяжная.
Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент.
В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов.
В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно.
Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений.
грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений
грешили на праймеры - заказали новые - ничего.
грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего
меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше.
концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело.
Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!!
Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье)))
Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом?
ПАМАГИТЯ!!!


вытиньти 10 меры ф тувалет возьмите 18 20 меры арбитрари праймед ПЦР и гоняйте на 20 сантиметров ПАГАХ с окраской СИБР гольдом получите 40 полиморфов в дорожку
yorik, 20.12.2014 21:52
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33)
Link to the original post  Проблема затяжная.
Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент.
В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов.
В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно.
Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений.
грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений
грешили на праймеры - заказали новые - ничего.
грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего
меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше.
концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело.
Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!!
Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье)))
Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом?
ПАМАГИТЯ!!!


не связыватся с РАПД особенно на 10 мерах smile.gif
yorik, 20.12.2014 22:48
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33)
Link to the original post  Проблема затяжная.
Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент.
В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов.
В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно.
Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений.
грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений
грешили на праймеры - заказали новые - ничего.
грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего
меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше.
концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело.
Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!!
Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье)))
Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом?
ПАМАГИТЯ!!!


какие полимеразы какой циклер
Guest, 21.12.2014 19:14
недбзя всерьез обсуждать принципиально невоспроизводимый говеный метод
RNK, 21.12.2014 20:34
1. надо сократить число ПЦР циклов
2. уменьшить концентрацию геномной ДНК
3. повысить отжиг с 36 до 50 градусов
4. сменить ПЦР буфер на менее эффективный, чем той что рекомендуется для полимеразы (меньше магния, без Tween 20/Triton X100)
5. потенциально - снизить концентрацию праймеров в 2-3 раза
Guest, 21.12.2014 23:05
отличный совет для прекрасной методики- сменить буфер на МЕНЕЕ эффективный.
А также полимеразу на менее активную и циклер на более тормознутый. А зарплату на менее высокую -не-а?
-Ъ-, 22.12.2014 14:31
(Guest @ 21.12.2014 20:14)
Link to the original post  недбзя всерьез обсуждать принципиально невоспроизводимый говеный  метод

Канешна, в эпоху NGS заниматься RAPD... no.gif
Но все равно есть желание помочь человеку, фотки выложил.
Повторяю свой встречный вопрос: В минус (без ДНК) контроле тоже есть шмеры?
RNK, 22.12.2014 18:38
NGS канет в прошлое, как и RAPD, поиграются и перестанут.

вот новое направление подходит Multicolor Super-Resolution DNA Imaging, для решения очень широких задач, даже шире чем в NGS и тем более у RAPD:

http://www.bionanogenomics.com/technology/irys-technology/

а на счёт воспроизводимости RAPD, то это метод воспроизводим как любой другой, в том числе и NGS, всё дело в чьих руках.
А NGS это очень сырой метод и намного чувствителен к качеству ДНК и всем этапам, на этом фоне RAPD - чудо метод.
RNK, 22.12.2014 18:42
(Guest @ 21.12.2014 22:05)
Link to the original post  отличный совет для прекрасной методики- сменить буфер на МЕНЕЕ эффективный.
А также полимеразу на менее активную и циклер на более тормознутый. А зарплату на менее высокую -не-а?


есть такие ПЦР ситуации, когда оптимальный ПЦР буфер - зло.
для одновременной амплификации нескольких полос, может быть оптимальным буфет тот, который "помогает" всем полосам одновременно амплифицироваться, а не самому эффективному ампликону, во вред остальным
Эта очень серьезная проблема в ПЦР, и решается с большим трудом, и сейчас главным образом преодолевается за счет эмульсионного ПЦР.
lager, 22.12.2014 19:28
(Guest @ 21.12.2014 20:14)
Link to the original post  недбзя всерьез обсуждать принципиально невоспроизводимый говеный  метод


в принципе метод воспроизводимый просто ручки не из того места растут smile.gif
-Ъ-, 22.12.2014 22:12
(lager @ 22.12.2014 20:28)
Link to the original post  в принципе метод воспроизводимый просто ручки не из того места растут  smile.gif

yes.gif термоблок тестировать. umnik.gif
Soulmate, 25.12.2014 21:19
В - контроле шмер нет...
Я понимаю негодование по поводу RAPDa. Но доделать вроде надо. Зря я что ли вожусь битый год над этим.
-Ъ-, 25.12.2014 22:36
Хот-старт используется в реакции?
Pharmaсol, 25.12.2014 22:49
помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров.
мда.. было время
Panaev, 26.12.2014 09:06
Куда уходят бенды,
в какие города...

Навеяло smile.gif
-Ъ-, 26.12.2014 11:45
...но где найти нам СРЕДСТВА,
чтобы попасть туда. mol.gif

smile.gif beer.gif
-Ъ-, 26.12.2014 11:49
(Soulmate @ 25.12.2014 22:19)
Link to the original post  В - контроле шмер нет...
Я понимаю негодование по поводу RAPDa. Но доделать вроде надо. Зря я что ли вожусь битый год над этим.

Возможно в реакции незаметно от Вас появился денатурирующий агент типа глицерина, формамида т.д.
Спросите у продавца что они "там" изменили.
Guest01, 31.12.2014 18:38
(Pharmaсol @ 25.12.2014 23:49)
Link to the original post  помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров.
мда.. было время

http://takt.tomsk.ru/db/song.showSongText?sid=206

beer.gif beer.gif beer.gif smile.gif smile.gif smile.gif smile.gif
Guest01, 31.12.2014 20:54
(Pharmaсol @ 25.12.2014 23:49)
Link to the original post  помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров.
мда.. было время

все прекрасно воспроизводится учи матчасть smile.gif

Була
т
С
.
А.
,
Мироненк
о
Н
.
В
.
Полиморфиз
м
дрожжеподобног
о
гриб
а
Aureo
-
basidiu
m
pullulan
s
(D
e
Вагу)
,
выявляемы
й
в
полимеразно
й
цепно
й
реакци
и
с
универсальным
и
праймерами
:
состояни
е
дивергенци
и
вид
а
/
/
Генетика
.
1992
.
Т
.
28
,
N
4
.
С
.
19—29
.
Guest01, 01.01.2015 14:36
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33)
Link to the original post  Проблема затяжная.
Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент.
В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов.
В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно.
Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений.
грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений
грешили на праймеры - заказали новые - ничего.
грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего
меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше.
концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело.
Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!!
Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье)))
Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом?
ПАМАГИТЯ!!!


3 бенда ето не рапд возьмите хороший циклер типа Верити Фаст праймеры от 18 20 нт агароза как предпрогонка потом 20 сантиметров ПАГ
Guest01, 01.01.2015 15:49
(Pharmaсol @ 25.12.2014 23:49)
Link to the original post  помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров.
мда.. было время


а если гином неизвесен ты кабы сам будешь доби вать СССРы wink.gif

- А вдруг ты завтра попадёшь на остров в океане?
- На остров, вот здорово.
- А как же ты там проживёшь без повара, без няни?
- А я найду кого-нибудь.
-Да хорошо бы кабы-так,
Но мы-то знаем,
Что этот остров,
Что этот остров,
Что этот остров,
Необитаем.
-Необитаем?
-То есть абсолютно.

- Подушек нет, матрасов нет,
Нет ни одной кроватки.
- А я на травке буду спать.
- Простудишься на травке.
- Костёр, костёр, костёр.
- А я велю разжечь костёр.
- Но мы же знаем,
Что этот остров,
Что этот остров,
Что этот остров,
Необитаем.
- Что, совсем необитаем, да?
- То есть абсолютно.
MAAccountancy, 27.08.2021 15:25
One end of the band is placed on the upper canine tooth, while the other end is placed on the lower first molar. This creates a force that brings the upper jaw back towards the rest of the mouth to reduce the overbite.

payroll management in slough
bookkeeping & VAT services slough
Company secretarial services slough
nigoal123, 21.12.2021 10:05
An article is written. แทงบอล material that is read by an audience สล็อต123 make a wide-ranging impact on targeted readers. nigoal123 Articles can be written by marketing เซ็กซี่บาคาร่า or public relations departments SA Gaming to communicate an organization's

thought leadership while หวย providing relevant information QR Code linked with their industry. สล็อตออนไลน์ Some content writers may write Dream Gaming articles within a content management คาสิโนออนไลน์ system if they write them on a daily or weekly basis.
Lucille Robinson, 03.11.2022 02:55
then this method is reproducible like any other closest bank of america atm

including NGS, the whole thing is in whose hands.
And NGS is a very crude method and is much more sensitive to the quality of DNA and all stages
This is a "lo-fi" version of our main content. To view the full version with more information, formatting and images, please click here.
Invision Power Board © 2001-2022 Invision Power Services, Inc.