Здравствуйте, уважаемые форумчане.
Посоветуйте, пожалуйста, оптимальную по цене высокоточую ДНК-полимеразу или ПЦР кит.
Критическим является ее полная чистота от остатков геномной ДНК продуцента, так как амплифицируется ген 16S рРНК с использованием универсальных для всех прокариот праймеров. К сожалению, не все полимеразы (особенно отечественные) соответствуют этому критерию.
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Посоветуйте Полимеразу
AlexMerkel, 09.10.2015 13:50
R.J.Dio, 10.10.2015 14:59
отечественнвые-не отечественные- это не имеет значения. Практически все коммерческие полимеразы содержат геном E.coli. Проверить этот тезис просто- поставьте ПЦР без матрицы на 16s E.coli, и к 35 циклу +/- все придет. Существуют крайне дорогие полимеразы, специально (якобы) очищенные от геномной ДНК, но назвать их оптимальным по цене - это вряд ли. Хотя кому что оптимально...
AlexMerkel, 10.10.2015 15:16
(R.J.Dio @ 10.10.2015 15:59)
поставьте ПЦР без матрицы на 16s E.coli, и к 35 циклу +/- все придет. Эх, если бы к 35ому циклу или выше - это еще куда не шло. Часто и на 30ом уже виден продукт.
А неужели какая-нибудь NEBовская Q5 HF ДНК-полимераза тоже не до конца очищена от геномки E.coli (или кто там у нее продуцент)?
Хотя известно, конечно, что ДНКаза I не очень эффективный фермент.
AlexMerkel, 10.10.2015 15:35
(husten @ 10.10.2015 16:15)
на 16с микробиом в принципе полимираза не влияет делаю 16с на Miseq 2 по 250 парноконцевых ригулярно праймеры на V4
Да, если у Вас продукт с Вашей матрицы (тотальной ДНК изучаемого микробного сообщества) выходит на плато еще до того, как в -k (реакции без добавления матрицы) продукт начал накапливаться в заметных количествах, то контаминированность ДНК-полимеразы не может существенно повлиять на результаты секвенирвания. Так обычно и происходит. Проблема возникает, когда концентрация ДНК в препарате очень низкая и контаминация полимеразы уже становится существенной.
R.J.Dio, 11.10.2015 10:34
NEBовская Q5 HF. И что? Название прикольное? Почему именно она? да нет, ДНК-free полимеразы обычно пишут, что именно такое свойство. Навскидку не припомню производителя. Это ведь ндо ДНКазить препарат и тщательно потом чистить от всего- от ДНКазы, от остатков генома, понятно, что игра стоит свеч, если рынок имеется, а в 90% аппликаций наличие генома никак не аффектирует
blij, 11.10.2015 15:08
(R.J.Dio @ 10.10.2015 13:59)
Существуют крайне дорогие полимеразы, специально (якобы) очищенные от геномной ДНК, но назвать их оптимальным по цене - это вряд ли. Хотя кому что оптимально...У Сигмы они по цене в два раза отличаются, вроде не крайне...
R.J.Dio, 11.10.2015 15:48
? тогда хорошо
AlexMerkel, 11.10.2015 15:58
(R.J.Dio @ 11.10.2015 11:34)
NEBовская Q5 HF. И что? Название прикольное? Почему именно она?Ну зарубежные коллеги советовали - на все случаи жизни)
Сам ей не пользовался.
(blij @ 11.10.2015 16:08)
У Сигмы они по цене в два раза отличаются, вроде не крайне...А есть ссылка? что-то я не могу найти именно с пометкой DNA free
blij, 11.10.2015 16:00
D7442 Sigma
MTP™ Taq DNA Polymerase
Taq DNA Polymerase, free of DNA contaminants
blij, 11.10.2015 16:38
Кстати у Zymo есть кит для квантификации бакт. ДНК (Femto™ Bacterial DNA Quantification Kit), вот там точно еколятины быть не должно и следа. Продается как премикс с SYTO-9 для куПЦР, стоит дешевле, чем голая сигмовская полимераза.
distemper, 12.10.2015 03:35
я где-то видел полимеразу в дрожжах продуцируемую, ссылку искать лень сейчас. вот производитель ее позиционировал как раз для ваших аппликаций
Andrey N, 12.10.2015 23:33
у Fermentas в свое время были нативные Taq и Pfu (уж не знаю где они термофилов выращивали). Может в каталоге у их приемников и сейчас что-то такое есть?
AlexMerkel, 13.10.2015 12:33
(Andrey N @ 13.10.2015 00:33)
у Fermentas в свое время были нативные Taq и Pfu (уж не знаю где они термофилов выращивали). Может в каталоге у их приемников и сейчас что-то такое есть?У Thermus aquaticus и Pyrococcus furiosus как и у всех остальных прокариот тоже есть 16S рРНК и это никак не снимает проблему. Вот дрожжи - это выход
-Ъ-, 13.10.2015 15:35
По Вашему изложению проблемы, у Вас самая обыкновенная контаминация ампликонами с этими самыми универсальными праймерами на 16S.
Поэтому нет таких полимераз...
Поэтому нет таких полимераз...
guest: Andrey N , 13.10.2015 16:29
"У Thermus aquaticus и Pyrococcus furiosus как и у всех остальных прокариот тоже есть 16S рРНК и это никак не снимает проблему. Вот дрожжи - это выход ".
1.) Да, но у архей оно немного хуже ПЦРится. Есть даже модификации универсальных 16S праймеров для архей, чтоб снять эту проблемку.
2.) Если только у Вас не метагеном из района Черных Курильщиков, думаю 16S Pyrococcus furiosus можно пренебречь при секвенировании.
1.) Да, но у архей оно немного хуже ПЦРится. Есть даже модификации универсальных 16S праймеров для архей, чтоб снять эту проблемку.
2.) Если только у Вас не метагеном из района Черных Курильщиков, думаю 16S Pyrococcus furiosus можно пренебречь при секвенировании.
blij, 13.10.2015 16:53
(guest: Andrey N @ 13.10.2015 15:29)
"У Thermus aquaticus и Pyrococcus furiosus как и у всех остальных прокариот тоже есть 16S рРНК и это никак не снимает проблему. Вот дрожжи - это выход ".1.) Да, но у архей оно немного хуже ПЦРится. Есть даже модификации универсальных 16S праймеров для архей, чтоб снять эту проблемку.
2.) Если только у Вас не метагеном из района Черных Курильщиков, думаю 16S Pyrococcus furiosus можно пренебречь при секвенировании.
Т.е. Вы думаете, что фермент прямо из этих самых Термусов и добывают напрямую?
guest: Andrey N, 13.10.2015 17:38
"Т.е. Вы думаете, что фермент прямо из этих самых Термусов и добывают напрямую?"
Дано:
1.) Дело происходило лет 10-15 назад, когда Fermentas еще был Fermentas, а не Thermo или Invitro. А Прибалтика не Евро.
2.) В каталоге парные позиции Taq и Pfu полимераз, отличающиеся тем что одна рекомбинантная, другая нативная.
3.) Специально для комментариев типа этого :
Выдержка из каталога фирмы MBI Fermentas за 2002-2003г., стр. 154-157.
-- # EP0281 100u (5u/mkl) Taq DNA Polymerase (native, without BSA). Purified from a thermophilic bacterium Thermus aquaticus YT1.
-- # EP0571 100u (2.5u/mkl) Pfu DNA Polymerase (native, Available in certain countries only). Purified from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus.
-- # EP0401 100u (5u/mkl) Taq DNA Polymerase (recombinant). Purified from an E.coli strain carrying a plasmid with the cloned gene encoding Thermus aquaticus DNA polymerase.
Дано:
1.) Дело происходило лет 10-15 назад, когда Fermentas еще был Fermentas, а не Thermo или Invitro. А Прибалтика не Евро.
2.) В каталоге парные позиции Taq и Pfu полимераз, отличающиеся тем что одна рекомбинантная, другая нативная.
3.) Специально для комментариев типа этого
: Выдержка из каталога фирмы MBI Fermentas за 2002-2003г., стр. 154-157.
-- # EP0281 100u (5u/mkl) Taq DNA Polymerase (native, without BSA). Purified from a thermophilic bacterium Thermus aquaticus YT1.
-- # EP0571 100u (2.5u/mkl) Pfu DNA Polymerase (native, Available in certain countries only). Purified from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus.
-- # EP0401 100u (5u/mkl) Taq DNA Polymerase (recombinant). Purified from an E.coli strain carrying a plasmid with the cloned gene encoding Thermus aquaticus DNA polymerase.
AlexMerkel, 13.10.2015 21:10
(-Ъ- @ 13.10.2015 16:35)
По Вашему изложению проблемы, у Вас самая обыкновенная контаминация ампликонами с этими самыми универсальными праймерами на 16S.Поэтому нет таких полимераз...
Уж поверьте - это первое что мы проверили.
Нет, контаминации нет. Сигнал из полимеразы.
(guest: Andrey N @ 13.10.2015 17:29)
1.) Да, но у архей оно немного хуже ПЦРится. Есть даже модификации универсальных 16S праймеров для архей, чтоб снять эту проблемку.2.) Если только у Вас не метагеном из района Черных Курильщиков, думаю 16S Pyrococcus furiosus можно пренебречь при секвенировании.
1) С универсальными праймерами на 16S рРНК архейные гены прекрасно амплифицируются.
2) У нас большинство метагеномов из термальных мест обитания, в том числе и морских.
Andrey N, 13.10.2015 22:45
" У нас большинство метагеномов из термальных мест обитания, в том числе и морских."
Тогда выход один -- дорогие сертифицированные как ДНКfree.
Ваши пробы Вам должны быть дороже ИМХО.
Тогда выход один -- дорогие сертифицированные как ДНКfree.
Ваши пробы Вам должны быть дороже ИМХО.
R.J.Dio, 14.10.2015 09:14
вааще не понял вопроса- если у Вас такая наука, то методы, равно как и средства, должны быть вдоль и поперек известны, к чему изобретать велосипед. Изучая геномы Вы должны быть в курсе- Россия- НЕ родина слонов!
AlexMerkel, 14.10.2015 16:39
(R.J.Dio @ 14.10.2015 10:14)
вааще не понял вопроса- если у Вас такая наука, то методы, равно как и средства, должны быть вдоль и поперек известны, к чему изобретать велосипед. Изучая геномы Вы должны быть в курсе- Россия- НЕ родина слонов!Все равно всегда все приходится оптимизировать и под конкретные образцы и под конкретные условия работы и под конкретные задачи, начиная от методов выделения ДНК и модификации праймеров, заканчивая скриптами обработки данных.
Хорошо, задам вопрос, так сказать, ребром))
Мы в 90% случаев пользуемся Еврогеновской полимеразой. Она нас устраивает, особенно ценой. У нее без добавления матрицы c универсальными праймерами на V4 регион 16S рРНК продукт выходит на плато к 34-36 циклу. Так как в большинстве случаев с добавлением матрицы нужный нам продукт выходит на плато к 22-25 циклу, то проблем нет, но примерно в 15% случаев продукт с матрицы выходит на плато лишь на пару циклов раньше, чем без матрицы и для этих случаев хотелось бы иметь полимеразу, у которой кол-во геномки E.coli. меньше чем у Еврогеновской. Так вот, имеет ли смысл покупать зарубежные полимеразы средней ценовой категории, допустим ту же NEBовскую Q5 Hot Start HF ДНК-полимеразу, с надеждой, что у нее продукт будет на плато выходить позже чем у Еврогеновской или они все примерно одинаковы по уровню контаминации геномкой E.coli?
kb1, 14.10.2015 18:28
(AlexMerkel @ 14.10.2015 17:39)
Так вот, имеет ли смысл покупать зарубежные полимеразы средней ценовой категории, допустим ту же NEBовскую Q5 Hot Start HF ДНК-полимеразу, с надеждой, что у нее продукт будет на плато выходить позже чем у Еврогеновской или они все примерно одинаковы по уровню контаминации геномкой E.coli?"Практика - основной критерий истины"
Не попробуете - не узнаете.
Думаю, что степень контаминации ДНКой у большинства полимераз одинакова. Объясняется это тем, что ДНК-полимеразы это ДНК-связывающие белки, и как правило находятся в связанном с ДНК состоянии. Полностью разрушить комплекс "ДНК и полимераза" и выделить чистый (без примеси НК) белок весьма затруднительно
-Ъ-, 24.01.2017 16:39
Если праймерам суждено димеризоваться, никакой хот старт их не спасает.
Другое дело если обратимое ингибирование полимеразы при температуре, близкой к темп. отжига!
TiTaq на эту тему?
Другое дело если обратимое ингибирование полимеразы при температуре, близкой к темп. отжига!
TiTaq на эту тему?
-Ъ-, 24.01.2017 16:43
(kb1 @ 14.10.2015 19:28)
"Практика - основной критерий истины" Не попробуете - не узнаете.
Думаю, что степень контаминации ДНКой у большинства полимераз одинакова. Объясняется это тем, что ДНК-полимеразы это ДНК-связывающие белки, и как правило находятся в связанном с ДНК состоянии. Полностью разрушить комплекс "ДНК и полимераза" и выделить чистый (без примеси НК) белок весьма затруднительно
Да и пора научиться избавляться от любой, не только еколиной, экзогенной ДНК без дополнительных извратов по очистке ДНК полимеразы, превращая ее стоимость в золото-платиново-титановую
watchesbiz, 23.11.2021 15:46
nigoal123, 19.05.2022 06:49
Anyone can connect with their audience through blogging and enjoy you who your readers are. the myriad benefits that blogging provides
organic traffic from from the first sentence. search engines promotional content for social media and recognition from a new audience you haven’t tapped into yet.
organic traffic from from the first sentence. search engines promotional content for social media and recognition from a new audience you haven’t tapped into yet.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.