Коллеги!Попробуйте оттрактовать следующий
феномен - делаю простую вещь - намножаю фрагмент с помощью М13праймеров. Шутки для,
отбираю одинаковые пробы на 20м,25м,30м,35м,
40м и 45м циклах и вижу в форезе, что все они
содержат одинаковое кол-во ДНК. В другой раз
PCRmix разделил на 6частей и повторил опыт. С
тем же результатом.Возникает и другой вопрос
- а как должен выглядеть результат этого опы-
та теоретически.Доп. информация - pUC57век-
тор, вставка - некий фрагмент ДНК пшеницы(600пн),полимераза,правда,не из самых-самых - из города Тарту.С уважением. tamm

Если взять для ПЦР около 0,00001 мкгмл или меньше матрицы, то разницу увидишь - это точно.

То есть , конечно, мкг/мкл, а то не увидишь вообще ничего %))

А теоретически он должен так и выглядеть, если б ты взял 5, 10, 15 и 20, то увидел бы зависимость. Или действительно оч. мало матрицы, меньше даже чем указал Colt порядка на 2-3.

Коллеги!Согласен с вами.Но вы немного уклонились.В ДАННОМ конкретном случае я хочу
не разницу увидеть,а понять почему ее (разницы) нет.Или другая формулировка - если
PCR "выходит на насыщение",то что означает
насыщение для PCR.Реакция то идет, новая ДНК
образуется и ... Или реакция не идет ,то
после первой же денатурации я увижу или кашу
или ничего. Так как же на самом деле?
С уважением. tamm

Ну, эээ, думаю все просто. Закончились трифосфаты)

Не обязательно, что трифосфаты закончились, причин выхода на стационар может быть много, в качестве дополнительных могу предложить расход праймеров и накопление пирофосфатов, ингибирующих полимеразу.
А разницы нет потому, что действительно много матрицы и стационар наступает где-то на 15 цикле, точно сказать нельзя.
А 45 циклов при амплификации с плазмиды - НЕ НУЖНО!!!
Кстати, для амплификации с хромосомы Е.коли я делаю 20(Sic!) циклов.

Ув. metallurger!Согласен с вами,что 45-ти
циклов не надо.Я ,собственно,пытался убедить
таким образом своих коллег,что их увлечение
PCR-м с 45- тью циклами безосновательно.
Полученный же результат показался странным мне самому.

Ваше предложение насчет расхода праймеров действительно почти все объясняет.
Попробую это проверить.Кстати! В случае с
PCR на праймерах микросателлитов (пшеницы)
авторы таки рекомендуют 45 циклов.Тут есть
какая-то разница? Просветите.
С уважением. tamm

Предположу, что в отношении матрица/полезный сигнал, ибо c сателлитами дела никогда не имел, но насколько я помню, их длина - несколько десятков пар, а всей хромосомы пшеницы - наверно 10 в 7-8. Вот и получается отношение - 10 в 6, когда как при амплификации с плазмиды - 10 в 1.

Советую вам поставить раститровку по количеству ДНК а затем ПЦР, при расчете на 20
цикле с 1 цепи ДНК матрицы образуется
~10exp(-11)грамм продукта, такое количество
на геле увидеть трудно, что скорее всего связанно с избытком матрицы. Истощение ингридиентов PCR исключено (хотя не полностью) в связи с добавлением большого их
избытка (в рекомендуемых посбиях).

Коллеги, не забывайте о MgCl2! При увеличении концентрации ДНК, магний с ней связывается, а на Taq-полимеразу уже не хватает.

Магний более эффективно связывается с dNTP, чем с ДНК (поэтому для реакции важно соотношение Mg/dNTP). В ходе реакции магний связывает образующийся РР. Поэтому количество связанного Mg в течение реакции относительно постоянно.
dNTP в большинстве протоколов берется с избытком.
По моему (небольшому) опыту, насыщение ПЦР обусловлено чаще всего количеством матрицы (соотношением матрица/ праймеры) и полимеразы. Активность полимеразы (особенно Taq)заметно снижается, что хорошо видно после 15-20 циклов.
Постоянство количества ДНК на форезе с 20 по 45 цикл-хороший результат с точки зрения стабильности, и говорит, наверное об исчерпании к-л компонента (праймеров, активности полимеразы или дНТФ). Чаще бывает такое, что если в 20-м цикле много целевого фрагмента, то в 40-м - мощная неспецифика. То же самое при избытке праймеров, полимеразы или матрицы.
А количество циклов нужно координировать с размером и количеством матрицы.
Не с каждой матрицы в принципе (особенно ДНК высших эукариот) можно получить чистые и ощутимые продукты ПЦР за 20 циклов.

Магний более эффективно связывается с dNTP, чем с ДНК (поэтому для реакции важно соотношение Mg/dNTP). В ходе реакции магний связывает образующийся РР. Поэтому количество связанного Mg в течение реакции относительно постоянно.
dNTP в большинстве протоколов берется с избытком.
По моему (небольшому) опыту, насыщение ПЦР обусловлено чаще всего количеством матрицы (соотношением матрица/ праймеры) и полимеразы. Активность полимеразы (особенно Taq)заметно снижается, что хорошо видно после 15-20 циклов.
Постоянство количества ДНК на форезе с 20 по 45 цикл-хороший результат с точки зрения стабильности, и говорит, наверное об исчерпании к-л компонента (праймеров, активности полимеразы или дНТФ). Чаще бывает такое, что если в 20-м цикле много целевого фрагмента, то в 40-м - мощная неспецифика. То же самое при избытке праймеров, полимеразы или матрицы.
А количество циклов нужно координировать с размером и количеством матрицы.
Не с каждой матрицы в принципе (особенно ДНК высших эукариот) можно получить чистые и ощутимые продукты ПЦР за 20 циклов.

W gel-elektroforeze wi mozete rasspoznat 2 nanogramma DNA. Bolsche 45 ciklow-erunda pod sousom po moemu woobsche. Poprobujte start nachat s 10000 molekul w tempplate i tak dalee. A esli zelaete kolichestwennij analiz PCR produkta prowesti, to obratites k PCR ELISA naprimer, tak kak chelowecheskij glaz w UV swete ne ochen to tona razlichaet.

Коллеги!Согласен,практически,со всеми Вашими соображениями.Но!Имеет место некоторая неудовлетворенность.Попробую объяснить.Если
реакция идет штатно,то кол-во ДНК растет.
Если реакция перестает идти штатно,то почти
сразу материал должен превратиться в кашу -
денатурация прошла,а полимеразная реакция нет
(или проходит с отклонениями, несовместимыми
с понятием целевой продукт).Об этом же ,по
сути,говорят и все высказанные мнения(прямо
или косвенно).Я тоже считаю,что нормальное
протекание реакции заканчивается
к 20-му циклу.И я совершенно не понимаю как,
после этого,ничего не меняется(судя по форезным картинкам) на протяжении аж 25-ти циклов.Заранее прошу прощения за некоторое
занудство - но я не прошу бороться с этим
фактом,я хочу понять почему ЭТО имеет место.
С ув.tamm
PS Мне кажется,что анализ подобных частностей
,иногда,помогает лучше разобраться в сути
дела(это я про себя).

Попробую ответить на последний вопрос - если ПЦР прошла как надо к 20-тому циклу, то почему нет изменений к 45-тому циклу, видимых в геле? Ответ достаточно прост, если ответить сначала самому себе, а что значит КАК НАДО? Очевидно, что в этом случае был амплифицирован именно тот фрагмент ДНК, который хотелось амплифицировать. То есть после каждого цикла Вы получали двукратное увеличение той самой последовательности, которая нужна, без всяких побочных продуктов. И после того как, начиная с какого-то цикла, это увеличение стало невозможно (я намеренно опускаю вопрос - почему невозможно, - по большому счёту не об этом речь, а объяснения - см. предыдущие сообщения), концентрация амплифицированной ДНК остаётся практически постоянной. Конечно, кратковременные нагревания в течение последующих 20 (30, 40 и т.д.) циклов способствуют её деградации, но это же САМАЯ устойчивая биологическая молекула! Попробуйте понагревать полчаса при 95 С фрагмент ДНК 1-2 т.п.н. в буфере для ПЦР, какой будет процент дегредации? Ничтожный! Вот и всё.

Как я понимаю вопрос у tammа не про деградацию, а про денатурацию. Как мне кажется, при такой концентрации ДНК, какая есть уже к 20 циклу, на 95 градусах за те секунды денатурация полностью не идет и соответственно все это ренатурирует очень эффективно при понижении Т.
Предвидя дальнейшие вопросы замечу, что у Taq есть 5'3' активность которая "сбрасывает" комплементарную матрице цепь при элонгации.

Остается получить форезную картинку,но после
стадии денатурации.Можно и несколько точек
посмотреть.Но мне кажется,что денатурация -
штука достаточно серьезная.
Прошу прощения,я еще весьма зелен в сети и
невсегда врубаюсь в терминологию - ув.metalluger,я не совсем понял последний
абзац.Это получается денатурация,т.е. разде-
ление цепей ,осуществляемая ферментом Taq
полимеразой.Или...что?И при каких условиях
реализуется зта активность.
С ув.tamm

Угу, именно так. Не помню как это будет по-научному. Но смысл такой: денатурация полностью не идет. Происходит выпетливание цепей, и если концы плавятся, что почти наверняка, т.к. у крайних нуклеотидов число соседей меньше, чем у тех которые в середине, то при стадии отжига праймер шлепается на комплементарную последовательтность, а все петли схлопываются. Естественно, что это процесс статистический, зависящий от многих параметров. Напр, от присутствия праймера в объеме возле расплавленного конца, от степени плавления ДНК. Поэтому, успеет ли праймер сесть - сложный вопрос. Это к вопросу о количестве циклов.
Теперь, пусть у нас он успел сесть на конец нашего амплифицируемого фрагмента, однако, это не единственная область, вовлеченная в структуру двойной спирали. Амплификация в отсутствие расплетающей активности у полимеразы просто бы не шла. Эта активность реализуется при элонгации цепи.
Ну вот вроде так. Критикуйте:-)

Ув.metalluger!Kak это говорят...А! Ну очень
круто зайдено.Я в некоторой растерянности,сэр
Нет,честно - надо это осмыслить...
С ув. tamm.

К вопросу о ПЦР.Мне приходится делать
нестед ПЦР и вот что странно. Редко но бывает
что после второго раунда виден положительный
контроль 1го раунда (внешние праймеры)
-это может говорить только о том что
реакция 1го раунда чем то тормозится но чем
ведь я переношу одну десятую обьема первого
раунда. Плазмида 0.1пкг.Если понять причину
то многие проблемы с чювствительностью
решатся.А РР здесь не очень важен я думаю
потому что ведь я перенашу с первого раунда
фосфаты и другие продукты.С уважением Влад.

Читал я это все, читал и ...
Мне это напоминает спор о том, сколько надо пива, чтоб мало не показалось
Вопрос кому, когда и под какую закуску...
Выход ПЦР зависит прежде всего от эффективности синтеза, потом от количества циклов. А эффективность зависит от нескольких параметров, потому глупо спорить о том "сколько циклов нужно"
Могу предложить следующий эксперимент:
Берете любую плазмиду со вставкой и праймеры к вектору. Готовите PCR mix на несколько реакций и раскапываете две одинаковые серии с убывающим количеством матрицы. Скажем: 1нг; 0,1нг; 0,01нг. Для пущего еффекту возьмите плазмиду со вставкой 0,5 - 1кб. Потом каждую серию пэцээрите одинаково, но с разной температурой отжига. Для М13х праймеров (16меров) возьмите 50 и 56 градусов. Если конц. Mg2+ у вас 1.5-2mM, полимеразы 0.5-1U на 50мкл(хорошей!), праймеров 10-20 пмоль каждого на те же 50мкл, время отжига было20-30 сек, а синтеза около 1мин/Кв и вы сделали 30 циклов, то эффект гарантирован. Вы все поймете!
Если будет время и желание, можете таким же образом изучить влияние температуры и времени денатурации, причем ето будет особенно интересно если размер продукта больше 2-3 Кв.
Тем кто хочет почитать могу посоветовать вот это: http://www.bio-rad.com/cmc_upload/Literatu...df
Там есть общие соображения и много ссылок
Enjoy

В ответ на второй вопрос tamm.
Мне кажется, дело главным образом в двух вещах:
1) ПЦР, в тех условиях, когда она идет хорошо - реакция все-таки очень высоко специфичная. При истощении к-л компоненты ПЦР реакция скорее не пойдет вообще, остановится, чем пойдет неспецифично. Не надо ждать от нее мощной неспецифики.
2) Для неспецифики нужны определенные условия: избыток полимеразы (а после 20-го цикла ее активность часто составляет десятые или сотые доли от исходной), избыток праймеров (после 20 цикла... соответственно), избыток матрицы (имеется в виду не специфичный целекой фрагмент, а та исходная плазмида, геномная ДНК или другое, имеющая, вероятно, множество сайтов частичной гомологии), температура отжига существенно ниже оптимальной или большой дисбаланс реакционной среды, снижающий специфичность полимеразы. Всего этого после 20 цикла как правило нет, если не было изначально. Но добавьте полимеразу после 20 цикла - увидите нарастающую неспецифику. Такие штучки бывают с некоторыми высокостабильными полимеразами (Vent, несмотря на ее высокую точность) и без добавления новой порции, а также при щадящих условиях денатурации.
Очень многое зависит от последовательности (частичная гомология и самокомплементарность, G/C и т.д.) и длины праймеров (капризны праймеры примерно >30 и <15 оснований, т.е. те, температура отжига которых не влезает в рекомендуемые рамки) и целевых фрагментов (частичная гомология внутри целевого фрагмента может быть фатальным фактором).

В ответ Владу (guest 22-11-2001 16:32).
Ув. Влад! Конечно легко обсуждать чужие проблемы, но попробую (если я правильно понял, о чем речь). Мне кажется , если в конце реакции на форезе виден фрагмент 1 раунда, значит 1 раунд прошел хорошо, с высоким выходом. Ведь при отсутствие заметной неспецифики количество цепей фрагмента 1 раунда, перенесенного в реакцию 2 раунда остается неизменным. Может даже немного увеличиться (если температура отжига во втором раунде не выше или незначительно выше, чем в первом), если в конце первого раунда остается ощутимое количество праймеров. Разница во времени полимеризации не фатальна, т.к. это реальное время полимеризации часто оказывается избыточным, а неполные фрагменты могут досинтезироваться в последующих циклах. В последнем случае могут появиться минорные фоновые продукты.

В ответ metalluger.
Ув. metalluger! Впервые слышу про хеликазную активность термостабильной полимераз. Если есть источники, поделитесь, пожалуйста. А исходя из старых представлений, мне кажется что все дело в кинетике ренатурации. Кстати это тоже ВАЖНЕЙШИЙ ФАКТОР НАСЫЩЕНИЯ РЕАКЦИИ, о котором при обсуждении этой темы до Вашего напоминания все забыли (кажется, м.б. я упустил). Т.е. дело в том, что в начале ПЦР существует ничтожное количество матрицы, с которым почти мгновенно отжигаются праймеры, концентрации которых отличаются на порядки. В ходе реакции количество фрагмента экспоненциально растет. Пропорционально этому растет скорость ренатурации свободных его цепей, особенно при температуре отжига (при 72 град фрагменты ПЦР ренатурируют еще медленно и образуют не очень стабильные связи, тем более, что отжигающиеся с ними праймеры и особенно полимераза, ведущая синтез представляют собой значительные стерические затруднения для отжига цепей). При большом количестве фрагмента, сравнимом с количеством остаточных праймеров ренатурация цепей при температуре отжига проходит быстрее, чем отжиг праймеров и начало синтеза. Это ведет к остановке реакции даже без истощения компонентов реакционной смеси. Возможно, это и есть главная причина явления, которому посвещен вопрос TAMM и вся эта страница.

Т. е. это еще одна важнейшая причина снижения скорости и эффективности ПЦР, экспоненциально нарастающая привысоких циклах.

Ув. коллеги! Спасибо за интересную дискуссию.Я, (а,м.б. и не только я) стал понимать PCR значительно глубже,чем раньше.И,кста-
ти,я не уверен,что чтение литературы имело бы тот же эффект.Тем более,что прочитано ее (лит-ры) было изрядно(я имею в в виду - до
начала дискуссии),а ясность появилась далеко не сразу.
Теперь к делу.Соображения,высказанные metalluger-ом и aleksm-ом
по поводу ренатурации подводят черту и овечают на основной вопрос
- в циклах после 25-ого ничего не происходит из-за выхода реакции
на насыщение(скорее всего по совокупности причин) и,видимо главное, из-за "мгновенной" ренатурации.Все пробы взятые по ходу
денатурации и в нескольких точках в процессе "остывания" давали
в форезе стандартные зоны соответствующие искомому продукту(око-
ло 600нп).Такие зоны однозначно соответствуют обычному фрагменту
ДНК.В нашем случае - полностью ренатурировавшему к моменту нанесения на форез(1 - 1,5 мин).Добавлю следущее."Настоящая" де-
натурация ДНК - 5мин на кипящей бане - превращала зону в размытое
пятно.Исходя из этих данных похоже прав metalluger.Хотя,надо при-
знаться,соображения ув.aleksm-ма я прочитал с большим интересом
и ,практически, согласен по всем пунктам.К сожалению,пока не пре-
дставляю как все это можно проверить.
С уважением tamm.

F1 Renovations is one of the leading renovation companies all over the UK. We provide painting and decorating services, including all types of decoration like house renovation, kitchen renovation, bathroom renovation, tiling, flooring, etc. We provide quality service at cheap rates.

Removals Company | Removals Company | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling

Thank you for your post. I have read through several similar topics! However, your article gave me a very special impression, unlike other articles. I hope you continue to have valuable articles like this or more to share with everyone! wheel spinner

Strategic aircraft aff 1688might carpet bomb parts ทางเข้าufa1688of Ukraine, though so many ufabet เข้า สู่ระบบof its towns and cities ufa1688look like this has already ราคาบอลhappened. He might also สล็อตออนไลน์turn to chemical or biologica UFA1688weapons, although these would ลิงค์รับทรัพย์be too close to his own border for sanity แฮนดิแคปดor comfort, and would illicit บอลสเต็บan intense international response

I wanted to joker gaming help other people who had PG SLOT also been sexually harassed สล็อตxo (in the JSDF). As for ราคาบอล the perpetrators, I wanted an apology บาคาร่า and for them to admit sexybacarat to what they had done; I wanted 123GOAL to prevent others from going 123BET through what I went through Nigoal123 that’s why I spoke out สูตรสล็อต she said.