Коллеги! Проблема в том ,что мечение никак не идет.Если в стандартный mix (без С ) доба-
вляю метку,то не вижу вообще ничего.Варьирование параметров PCR и кол-ва
С ничего не дало (т.е.0 материала в форезах).
При этом в контролях (без метки и с С) все в
порядке.Поделитесь знаниями на сей предмет.
С уважением. tamm
PS PCR с М13 праймерами.

А может это вовсе не С(Р32), а А, или не альфа Р32, а гамма, или не dC, а рибоС. Вот он и не включается и не будет. Может новую метку попробовать?.

Ув. avor!Дело в том,что параллельно метка эта
используется в системе "Ready to go" и в nic
трансляции и весьма успешно.Но при мечении
коротких последовательностей (короче 400пн)
возникают сбои при использовании традиционных
подходов. PCR казался естественным решением коллизии.В итоге 100% неудача и ,главное, со-
вершенно непонятно почему.
С ув. tamm

И все-таки, я думаю, что дело в букве. Я не знаю, что такое "Ready to go", но в nic и PCR, полимеразы отнюдь не одни и те же, и сравнение сомнительно, способность кушать неправильные буквы у разных ферментов разная. Может попробовать к этой неправильной букве применить фермент с меньшей специфичностью к буквам, ну, например, термосеквеназу.
Кстати, а почему на коротких фрагментах сбои? А Вы не пробовали Кленова? или это и есть "Ready to go".

Ready to go и есть Кленов, только в удобной
форме. Так что насчет метки сомнений нет.
С ув. tamm

Если в реакционной смеси мало одного дНТП, реакция плохо идет. Вы не пробовали использовать смесь меченого и обычного С?

УВ. Colt!Пробовал и до сих пор пробую.Дело
оказалось непростым.Не буду утомлять подробностями,но действительно необходим
баланс (и довольно тонкий)между кол-вом ме-
ченного и немеченного С.При этом собственно
PCR (небольшое кол-во матрицы и 20-25циклов
ее размножения) так и не идет в присутствии
метки.Речь пока идет о 2-3х циклах, а ДНК
приходится размножать отдельно (без метки).
Заранее прошу прощения за некоторую косноязычность - некоторые вещи еще в работе
и полной ясности нет.
С Ув. tamm

Может, в таком случае легче пометить гаммой оба праймера и не мучаться?

А чья собственно метка ? Если отечественная - то проблема именно в ней. Гамма много лучше и если не нужна супер высокая удельная - лучше киназить праймеры. Так что согласен с Colt.

Ув. Colt & Kiskin! Прошу прощения за серость,
но нельзя ли чуть подробнее (или ссылочку,
лучше в сети).
С ув. tamm

ГаммаP32 киназой Т4 цепляется на 5'конец праймера. Протокол к киназе должен прилагаться, во всех старых сиквенсовых протоколах тоже это есть. Киназу надо купить хорошую! Можно метить один праймер, можно оба. Ставишь обычную амлификацию, и все!

Ув. Colt!Хочу кое-что уточнить.Я полагал,
что Р32 дает бета-распад.Поправте меня,если я
не прав.Если же я захочу использовать гамма-
распад,то вынужден буду использовать другой изотоп (например йод...).И еще.По моим при-
кидкам удельная активность зонда окажется на 3 порядка меньше, чем при использовании
фрагмента Кленова. Или еще меньше.Не слишком ли велика цена,как Вы полагаете?
С ув. tamm

Уважаемый Тамм!
Гамма - третья фосфатная группа на нуклеотиде( первая альфа, вторая бетта) - традиция в названии . Действительно фосфор 32 и 33 дают всегда бетта распад.
Использование гамма меченого АТФ в киназной реакции довольно популярный метод ( гамма АТФ - дешевле) . Удельная активность зонда будет гораздо меньше , правда , обычно , если метка свежая , то этого хватает. Неспецифики также будет меньше.

Ув. Gubanov Sergey!Спасибо за ясные и четкие разяснения.Сожалею лишь о том ,что
основной вопрос ( о мечении ДНК с помощью PCR
) не привлек Вашего внимания.
С ув. tamm.

Kholodnyi trifisfat dobavlyat' nado.
Taq (i lubaya drugaya termostabil'naya) polimeraza ne budet rabotat' esli konz. odnogo iz dNTP nije 0.1 mM. Na gele (agaroznom) produkt takoi reaktsii mecheniya ne uvidesh, viden shmer. Nado smotret' po vklucheniu metki.
A voobsche eto daleko ne samyi luchshii sposob prigotovleniya zonda s RADIOAKTIVNOI metkoi. Takoe delali v nachale 90 godov, no potom vse ob etom zabyli.
Takim sposobom metku mojno vognat' prakticheski vsu, no udel'naya vykhodit nizkaya.

F1 Renovations is one of the leading renovation companies all over the UK. We provide painting and decorating services, including all types of decoration like house renovation, kitchen renovation, bathroom renovation, tiling, flooring, etc. We provide quality service at cheap rates.

Removals Company | Removals Company | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling

On the network’s flagship aff 1688evening newscast, ทางเข้าufa1688Xi was shown wearing ufabet เข้า สู่ระบบa face mask and viewing ufa1688the displays at the Beijing ราคาบอลExhibition Hall where photos สล็อตออนไลน์of himself featured heavily. UFA1688He was accompanied by Premier ลิงค์รับทรัพย์Li Keqiang and other top leaders, แฮนดิแคปincluding all members of the party’s บอลสเต็บsupreme Politburo Standing Committee.

But the timing of Xi’s latest ufa1688absence had added UFA1688to the intense speculation. ราคาบอลXi is just weeks away สล็อตออนไลน์from the 20th Party Congress ลิงค์รับทรัพย์beginning October 16,at which แฮนดิแคปhe is widely expected to break บอลสเต็บwith tradition and be appointed aff 1688to a third term in power, further cementing ufabet เข้า สู่ระบบhis status as the most powerful Chinese 1688.comleader in decades.