Добрый день.
Посоветуйте пожалуйста где можно посмотреть информацию (или подскажите принципы) о том сколько нужно заложить дистальных нуклеотидов в праймере для конкретных (если я правильно понимаю есть различия) рестриктаз.
Заранее благодарен за помощь.

NEB catalog

Правильно ли я понял что прибавлять надо 6 нуклеотидов? Спрашиваю потому что мне казалось что меньше, не хотелось бы делать праймер излишне длинным.

Я 3 закладывал и работало. Образно говоря не меньше 2. На самом деле есть шанс и без них обойтись, но выход сильно снижается.

нет, вы неправильно поняли. для каждой рестриктазы - по разному. эта же инфа есть и в каталоге ферментас.

на надо вводить людей в заблуждение, а то из экономии не будут добавлять буквы и угробят потом кучу сил времени на клонирование.

Нет уже давно такой фирмы Ферментас. Продались с потрохами Thermo Scientific.

Я добавляю 3. Для некоторых рестриктаз написано, что необходимо больше, тогда больше.

Спасибо за ответы, когда определюсь с выбором рестриктазы - буду более конкретно искать. Насчет 6 нуклеотидов - вывод сделал из ролика на сайте NEB, вероятно что-то не понял.

если вешать 6, ну тогда просто сайт рестриктазы два раза. типа gaattcgaattc
но это перебор конечно. пустая трата букв при синтезе.

если вы бы еще написали то, что вы хотите сделать (цель работы), то может еще какие полезные советы появятся.
я например все ПЦР продукты клонирую в тупые вектора, а уже оттуда - переклонирую в конечные. плюсы - не надо вешать букв дополнительных, удобно секвенировать, всегда есть источник этог фрагмента в виде пплазмиды, можно добавить 2-3 сайта рестиркктаз - потом клонировать фрагмент в кучу разных векторов.

https://www.neb.com/tools-and-resources/usa...f-dna-fragments

Уважаемый ship, в интересующем меня векторе имеется один сайт для PstI в удобном для меня положении, мне нужно вставить в этот сайт фрагмент около 800 (пока не посмотрел фланкирующих праймеров). Вот в принципе и вся задача.

Уважаемый Tuco Ramires, Вы, как обычно, отвечаете максимально полно, доходчиво и полезно. Огромное Вам спасибо.

то есть в обоих праймерах будет PstI? и клонировать будете по одному сайту? а с плазмидой что потом делать будете?

а я никогда не парился и закладывал независимо от фермента 3 дополнительных буквы. это позволяет вести одноэтапное клонирование с обработкой ПЦР-продукта напрямую. если забудете добавить буквы, то заклонируете в два этапа, как пишет ship. но в вашем случае нужно еще будет проверить ориентацию вставки в векторе, если вам для экспрессии.

Уважаемый ship, Вы все верно поняли, в обоих праймерах предполагается сайты рестрикции. Внутри клонируемого фрагмента ген Т7-полимеразы под lac-промотором. В нужный момент надеюсь запустить экспрессию.

ну по клонированию все понятно. не понятно только почему по одному сайту.

более того "внутри клонируемого фрагмента ген Т7 промотора и лак-полимеразы..." ложусь в дур-дом

а я 9 добавляла всегда, именно чтобы не париться
3 бакса за 20 пар, а за 30 - 4, но зато никаких сомнений, что порезалось

Уважаемый ksm - Вы кончно же правы, описка, простите - гриппую и плохо соображаю.

Уважаемый ship, а какие "засады" могут ожидать в случае клонирования по одному сайту? Выбор был сделан по банальной причине - я сейчас выполняю эту работу не в генетической лабе и ограничен в выборе реактивов, не хочется покупать еще вторую рестриктазу ради двух реакций, хотел проскочить по дешевле.

Ну, у вас фрагмент может как бы немного задом наперед вставиться

ну вот ммм выше написал.
не знаю что у вас за вектор, как расположены генетические элементы и прочее, но обычно вставку клонируют все таки в каком то определенном направлении. если это конечно не просто заклонировать пцр продукт.
вам соответственно потом надо будет еще и ориентацию вставки ппроверять, для чего еще будут нужны телодвижения и дополнительные рестриктазы.

...либо дополнительный праймер "внешний", тогда ПиСиАром можно проверить

Спасибо,все вышеперечисленное я себе представляю. В моем случае и промотор и целевой ген находятся в клонируемом фрагменте. Я подумал что в таком случае не имеет большого значения направление фрагмента в векторе. Если я не прав - напишите мне пожалуйста, мне придется кое-что переиграть пока не поздно.

Насколько все же полезно общаться с умными людьми! Подумал я над вашими словами и решил что действительно лучше взять два сайта рестрикции разными рестриктазами. Вы все были абсолютно правы, колупаться выбраковывая ложноположительных еще та морока.

в принципе, вы правы, в вашем случае не имеет. но лучше следить, чтобы транскрипты на векторе и во вставке не "пересекались", а то РНК димеры появятся.

За много лет выяснилось, что NEB не всегда суперправ. В большинстве случаев для полилинкерных рестриктаз достаточно 6-7 нуклеотидов. Меньше - снижается эффективность. EcoRI жрёт и с одним, а может и без хвоста - но это уж не знаю. Но есть особо мерзкие ферменты - Nde I, Spe I, некоторые GC-шестёрки типа Apa I, которым этого мало и для них хорошо иметь оверхэнг в 12. Это же касается и большинства восьмёрок. Вообще rule of thumb - видите, что рестриктаза "странная" (ну, например, Nae I) - вешайте немного побольше, чем 6-10.

Почему в полилинкерах рестриктазы часто стоят ближе и всё работает - хороший вопрос. Может даже тема для изучения Возможно, потому, что в таких случаях разрезание происходит стохастически, и если порезалась сначала "плохая" рестриктаза, то клонирование проходит, а если "хорошая", то плохая не режет, но мы этого не видим, потому что снижение эффективности на 50% в рутинном клонировании никак не заметить. А может, липкие концы, которые оставляет большинство рестриктаз, могут быть короче, чем тупые. В общем, простор для фантазии

для SalI и NotI тоже надо вешать больше, чем заявляют каталоги, так для инфы.

на роль рестриктаз предполагается пригласить EcoRI и HindIII, надеюсь от них подвоха ждать не стоит.

Еще одну тему заведет что с ней делать. Хотя если концы тупые - то можно и по одному фигачить, с проверкой ориентации вставки ПЦР праймерами плазмида-вставка. Это самый дешевый и простой способ с первого раза что-то получить и не маяться оптимизацией отношений вставка-плазмида при лигировании. Если вырастет сотня колоний, из 20-30 на скрининге 2-3 будут всегда с залигированным инсертом в правильной ориентации. По крайней мере - у меня так было всегда.

Если по теме - если повесите мало - рестриктаза заингибируется этими сайтами и все вывалится из раствора. Или вообще не порежется. Советую лепить не менее 10 дистальнее сайта рестрикции.

ужас. стоко букв. В смысле, написано. По-русски. Надо было в разговор влезть раньше. Короче, так. Инфа в NEB по поводу, скоко букв вешать, относительно полезная- они на олиго-дуплексах тестили, что совершенно не одно и то же, что длинная ДНК- один конец типа бесконечный, другой короткий. Поэтому все работет не совсем так, как пишут. Всегда в последние лет дцать взял себе за правило- ВСЕГДА 4 буквы- безотносительно рестриктазы. ВСЕГДА работает, и в ПЦР-продуктах, и в синтетических дуплексах, тем более в векторах. Не надо тут огород городить

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk

Anyone can connect บาคาร่าออนไลน์ with their audience slot xo through blogging and enjoy 11hilo you who your readers are. สล็อต the myriad benefits that 123GOAL blogging provides

organic traffic from nigoal from the first sentence.ลิงค์รับทรัพย์ search engines promotional พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง content for social media ราคา บอล and recognition from a new Hotgraph audience you haven’t tapped into yet.

For the past 15 years, India Pggame123 and China have vied 88ktc for favourable diplomatic สล็อต123 and trade relations 123bets with Sri Lanka thanks 11hilo to its strategic location in the Indian หวยปิงปอง ocean. While popular perception สล็อต123 indicated China had outpaced India, the 123VEGA recent economic and Dreamgaming political turmoil in Sri Lanka seems to ปั่นสล็อต have given India's foreign policy.