 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
После рестрикции продукты другого размера
aspiranto4ka, 27.01.2017 11:10
Добрый день. После разрезания продуктов ПЦР ресриктазой Bmg B I получаются продукты другого размера. Пробовала увеличить концентрацию рестриктазы. Без изменений. Рестрикция шла три часа. Подскажите, может увеличить время реакции? 6 часов достаточно?
AlexRez, 27.01.2017 11:14
А может вы не то режете или не тем?
aspiranto4ka, 27.01.2017 11:17
Ампликоны нужного размера, сума размеров продуктов после рестрикции, как нужно. Есть подозрение, что рестриктаза "не дорезала" ампликоны.
aspiranto4ka, 27.01.2017 11:19
Например, получаю ампликон 321 п.н. (как в литературе), после рестрикции - 183+138 п.н., а заявлено в литературе 183+76+62 п.н.
sceptique, 27.01.2017 11:22
Картинка нужна. А на картинке геля - лестница длин. Поскольку часто бывает, что рестриктаза после разрезания не освобождает продукт и "повисает" на нем, если то, что она отрезала очень короткое и само не может "отвалиться" от нее в раствор.
Сколько у Вас с короткого конца от сайта отрезания остаётся нуклеотидов? (вопрос снимается, 62 нуклеотида это довольно длинный хвост, должен отваливаться без проблем).
Вы свой ЦЕЛЫЙ ПЦР-продукт проверяли по сиквенсу на наличие дополнительных сайтов, которые эта рестриктаза может резать?
Если ампликон Вы получаете с человечей или эукариотической ГЕНОМНОЙ ДНК, то в месте, которое не режется может быть вариация или SNP.
Сколько у Вас с короткого конца от сайта отрезания остаётся нуклеотидов? (вопрос снимается, 62 нуклеотида это довольно длинный хвост, должен отваливаться без проблем).
Вы свой ЦЕЛЫЙ ПЦР-продукт проверяли по сиквенсу на наличие дополнительных сайтов, которые эта рестриктаза может резать?
Если ампликон Вы получаете с человечей или эукариотической ГЕНОМНОЙ ДНК, то в месте, которое не режется может быть вариация или SNP.
-Ъ-, 27.01.2017 12:07
(sceptique @ 27.01.2017 12:22)
Картинка нужна. А на картинке геля - лестница длин. Поскольку часто бывает, что рестриктаза после разрезания не освобождает продукт и "повисает" на нем, если то, что она отрезала очень короткое и само не может "отвалиться" от нее в раствор.Это Вы сами придумали? Не ковалентно же "повисает"!
Недорез или ассоциированные (сцепленные) полиморфизмы.
Попробуйте на выборке образце и (или) на большом количестве дублей от одного образца.
И не жалейте заварки!
ship, 27.01.2017 12:21
если ПЦР генома человека то плюсую за полиморфизм. порежьте другой рестриктазой, чтобы убедится что продукт ПЦР правильный. дальше можно на сиквенс отдать.
aspiranto4ka, 27.01.2017 12:21
Спасибо за ответы. Сиквенс продукта ПЦР не делали.
Анализировали выборку образцов разного происхождения.
Добавляли по 1 и 2 мкл рестриктазы в 30 мкл общей смеси. Производитель в инструкции пишет, что нужно увеличить или уменьшить количество рестриктазы и времени реакции. Буду пробовать увеличивать время реакции, т.к. добавление 2 мкл вместо 1 мкл рестриктазы не привело к изменениям размеров.
Анализировали выборку образцов разного происхождения.
Добавляли по 1 и 2 мкл рестриктазы в 30 мкл общей смеси. Производитель в инструкции пишет, что нужно увеличить или уменьшить количество рестриктазы и времени реакции. Буду пробовать увеличивать время реакции, т.к. добавление 2 мкл вместо 1 мкл рестриктазы не привело к изменениям размеров.
sceptique, 27.01.2017 12:38
Мда. -Ъ-, не все ли равно, ковалентно или нет? Если на агарозе этот борщ даже отстаёт от непорезанного ампликона? Это особенно часто нужно помнить всяким любителям формировать сайт рестрикции при помощи праймера, оставляющего 20-25 нуклеотидов между сайтом рестрикции и краем ампликона.
Вы прошерстите dbSNP того вида, который ПЦРили, и посмотрите карту с частотами SNP того, что попадает между Вашими праймерами. Это быстрее, чем секвенировать Ваш продукт, хотя и не доказательно и секвенировать все равно придется.
Обычно эти рестриктазы для того и используют, чтобы определять, есть однонуклеотидная вариация (SNP) или нет.
Вы прошерстите dbSNP того вида, который ПЦРили, и посмотрите карту с частотами SNP того, что попадает между Вашими праймерами. Это быстрее, чем секвенировать Ваш продукт, хотя и не доказательно и секвенировать все равно придется.
Обычно эти рестриктазы для того и используют, чтобы определять, есть однонуклеотидная вариация (SNP) или нет.
dk, 27.01.2017 12:46
У Вас же по весам: явно хорошо режется в 1 позиции, и не режется - по 2. Т.е. рестриказа работает нормально. Значит либо изменён сайт рестрикции, либо как-то хитро образовались шпильки и вторичная структура не даёт сесть ферменту (что маловероятно). Для рестрикции такого объёма 2 часа - имхо, мало. Я обычно оставляю на ночь - там уж точно всё "порежется" как надо.
Но лучше всего отсиквенируйте хотя бы в 1 конец ПЦР-продукт - понятно станет что и где у Вас режется. Займёт у Вас это лишний день - но всяко проще, чем мучиться и гадать "чё бы поменять в протоколе".
Но лучше всего отсиквенируйте хотя бы в 1 конец ПЦР-продукт - понятно станет что и где у Вас режется. Займёт у Вас это лишний день - но всяко проще, чем мучиться и гадать "чё бы поменять в протоколе".
-Ъ-, 27.01.2017 12:56
мкл ферментов ни о чем не говорят. 
ПЦР продукта в мкл берите на рестрикцию минимальное количество (2-5 мкл), столько сколько позволяет реальное количество в нг ПЦР продукта, т.е. после рестрикции самые короткие фрагменты должны быть видны хорошо. Этим Вы добиваетесь частичной смены буфера ПЦР на рестриктазный.
Или же надо чистить ПЦР продукт... Я сам никогда этого не делал из-за, сами понимаете, чего.
Если ПЦР идет с димерами и неспецификой, Вам "недорез" обеспечен на всю оставшуюся жизнь.
ПЦР продукта в мкл берите на рестрикцию минимальное количество (2-5 мкл), столько сколько позволяет реальное количество в нг ПЦР продукта, т.е. после рестрикции самые короткие фрагменты должны быть видны хорошо. Этим Вы добиваетесь частичной смены буфера ПЦР на рестриктазный.
Или же надо чистить ПЦР продукт... Я сам никогда этого не делал из-за, сами понимаете, чего.
Если ПЦР идет с димерами и неспецификой, Вам "недорез" обеспечен на всю оставшуюся жизнь.
sceptique, 27.01.2017 13:15
ТС похоже даже не проверяла ампликон на снипы сама по их базе. О чем дальше можно говорить?
Это нужно было делать сразу после чтения статьи, где "а заявлено в литературе 183+76+62"
Это нужно было делать сразу после чтения статьи, где "а заявлено в литературе 183+76+62"
ASDF, 27.01.2017 16:07
Про форез напишите. Может вы просто 76 и 62 не можете разделить
genseq, 27.01.2017 19:23
(aspiranto4ka @ 27.01.2017 09:19)
Например, получаю ампликон 321 п.н. (как в литературе), после рестрикции - 183+138 п.н., а заявлено в литературе 183+76+62 п.н.Форез на ПААГ? Если на агарозе, то 76 и 62 п.н. не разделятся. Да и от 138 п.н. эту парочку отличить будет затруднительно.
ship, 28.01.2017 00:17
(genseq @ 27.01.2017 17:23)
Форез на ПААГ? Если на агарозе, то 76 и 62 п.н. не разделятся. Да и от 138 п.н. эту парочку отличить будет затруднительно.138 от 76 нельзя отличить в агарозе? что за глупость...
ksm, 28.01.2017 02:18
(genseq @ 27.01.2017 20:23)
Форез на ПААГ? Если на агарозе, то 76 и 62 п.н. не разделятся. Да и от 138 п.н. эту парочку отличить будет затруднительно.в 3% вроде должны бы разделиться
sceptique, 28.01.2017 17:49
Если у неё там сайта для рестриктазы нет - она еще полгода будет на агарозе проверять, делится 76 и 62 или нет...
R.J.Dio, 28.01.2017 19:16
(aspiranto4ka @ 27.01.2017 12:19)
Например, получаю ампликон 321 п.н. (как в литературе), после рестрикции - 183+138 п.н., а заявлено в литературе 183+76+62 п.н.и что? ну нету сайта, по причинам: ПЦР-замена на первом цикле ПЦР, вариативность фрагментов- попробуте переставить ПЦР или взять больше образцов в анализ. Если 1 сайт порезался, то и другой тоже должен, если он есть. Мин за 15, остальное- от лукавого
sceptique, 29.01.2017 04:25
ПЦР-замена на первом цикле всех нескольких тысяч молекул шаблона?
R.J.Dio, 29.01.2017 13:33
(sceptique @ 29.01.2017 05:25)
ПЦР-замена на первом цикле всех нескольких тысяч молекул шаблона?а, ну да, продукт -то неклонированный. Ну, стало быть, не надо свято верить в "теоретические " сиквенсовые данные. Ну нет там сайта, и все. Лезвие Оккама подсказывает, что это first choice
sceptique, 29.01.2017 15:18
Мне это подсказывает, что если человек даже не проверяет сиквенс ампликона, который нужно рестриктазой резать, то нужно задуматься, стоит ли дальше себя мучать в аспирантуре... Человеку явно побоку молекулярная биология.
ship, 29.01.2017 18:51
(sceptique @ 29.01.2017 02:25)
ПЦР-замена на первом цикле всех нескольких тысяч молекул шаблона?я вот всю думал, чтото похоже по стилю. и вот ты спалился, за что забанили ЯМР гая?
sceptique, 29.01.2017 22:30
Ну, спросил бы, чего думать то. 
Надоело анонимные прокси менять, много возни слишком, ленивый я стал.
Надоело анонимные прокси менять, много возни слишком, ленивый я стал.
-Ъ-, 30.01.2017 10:53
(ship @ 29.01.2017 19:51)
я вот всю думал, чтото похоже по стилю. и вот ты спалился, за что забанили ЯМР гая?За всеядность... Но исправляться им поздно - старый стал и ленивый.
LMP, 30.01.2017 12:38
(aspiranto4ka @ 27.01.2017 09:19)
Например, получаю ампликон 321 п.н. (как в литературе), после рестрикции - 183+138 п.н., а заявлено в литературе 183+76+62 п.н.оно?
"The wild type will display fragments of 183 + 138 bp. GM40 (A 122T): display fragments of 183 + 76 + 62 bp. Heterozygous individuals will display fragments of 183 + 138 + 76 + 62 bp"
sceptique, 30.01.2017 15:28
Что и требовалось доказать. Аспирантке дали проверить подсолнух на ГМО, она нашла два банда = гомозигота без искусственной мутации, то есть - обычный подсолнух. Радовалась бы, что это не запрещенный мутант-ГМО из "Дня триффидов", а ей всё не так.
"GenBank Accession No. AY541455 for the sunflower haplotype that carries the A205V mutation is 312 bp. Fig. 4 shows that the PCR reaction described permits to discriminate both A122T and A205V mutants based on the presence of an INDEL polymorphism between their sequences."
"GenBank Accession No. AY541455 for the sunflower haplotype that carries the A205V mutation is 312 bp. Fig. 4 shows that the PCR reaction described permits to discriminate both A122T and A205V mutants based on the presence of an INDEL polymorphism between their sequences."
watchesbiz, 23.11.2021 15:46
nigoal123, 19.05.2022 06:49
Anyone can connect with their audience through blogging and enjoy you who your readers are. the myriad benefits that blogging provides
organic traffic from from the first sentence. search engines promotional content for social media and recognition from a new audience you haven’t tapped into yet.
organic traffic from from the first sentence. search engines promotional content for social media and recognition from a new audience you haven’t tapped into yet.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.