Добрый день)
Скажите, пожалуйста, от чего появляются экстра бенды после рестрикции?
При чем нужные фрагменты есть, но все таки смущает неспицифика.
Плазмида та, с ней же ставила ПЦР и она идёт нормально.
Использую ферменты XbaI , SphI, Cut Smart Buffer, концентрацию ДНК меняла по-разному, картина практически не меняется

Грязная плазмида.
Неспецифичные плохие рестриктазы
Перегруз по рестриктазам.

если CutSmart, то, очевидно рестриктазы NEB, родные, вряд ли плохие. Без картинки сказать ничего конкретного гельзя, может, это и не неспецифика вовсе. перво-наперво, надо параллельно наносить нерезанный контроль, то есть ту же плазмиду в тех же кол-вах и в том же буфере, инкубированную так же, только без фермента. после этого можно хоть о чем-то говорить. А аообще, Вам надо руку ставить сначала, а потом все остальное

протрансформируйте ее, почистите и еще раз порежьте, вдруг у вас там больше одной плазмиды

так же полезно бы знать размер полос, это может быть как недогрыз так и перегрыз (что врядли, катсмарт, вроде)

.

Я уже какой раз пытаюсь скинуть картинку, но сайт не даёт, считает за спам

Оказывается, что можно и руку, и рестрикцию ставить параллельно

это для особо талантливых. моя первая руководительница говорила примерно так: все ученые делятся на 3 категории: первые, их крайне мало, они берут методику, читают, делают-и все получается. Вторые, большинство, берут методику, читают, делают, ошибаются, им объясняют, где ошибка, они делают, и получается. Есть и третья группа, тоже немалая....с ней уже понятно.

я офигеваю от снобизма соотечественников в вопросах рестрикции да чему там получаться-то... чай, не дерьмовые ферменты 70-х в десятикратном разведении.

Автору, выложите на какое-нибудь облако, а ссылку дайте без гиперлинка, а то умру от любопытства

Esya, Вы прямо витаете, небожитель, так сказать... И всегда стремитесь припасть к источнику!
Кстати, о рестриктазах. И в 70-х рестриктазы от НЕБа были не "такие" .
НЕБ и сейчас НЕБо
Покупаю только попробовать, сравнить.

У Вас рестриктаза не только на геле лишние фрагменты оставляет.

У Вас или в инсерте дополнительный сайт БЫЛ (сам по себе), или в ходе Вашего "мутагенеза" образовался. Первое более вероятно. Кстати, это бы объяснило почему у Вас шмер на геле - просто всё по липким концам наслипалось в тонны клубков ДНК прямо в растворе при RT.

мы че обсуждаем- картинки нет? Столько всего навыдумывать можно. готов согласиться со всеми- но картинку бы поглядеть

кстати, NEBовские не такие дорогие, вполне можно себе позволить, если бы их еще по 2 месяца не везли на собаках. Но если вдолгую, то и это не важно, коллекция формируется, и все хорошо. Да и наши сибирские тоже норм. сейчас, особой разницы не вижу, они вполне окультурились за годы патронажа NEBа, классика колониализма

Вот, 2 - что получается , 1 - что в идеале должно быть

ну вот, все понятно. Спешу Вас обрадовать, у Вас абс. норм. рестрикция, целевая полоса жирная, все, что сверху- это скорее всего, геномка, которая не порезалась (да будет известно, что геномки при выделении плазмиды всегда прилично, зависит от способа и умения выделять плазмиду и от масштаба выделения, кстати, тоже, но это отдельная тема) либо такие формы плазмиды, которые не режутся никогда- всякие конкатамеры и пр, могу ошибаться в терминах. Словом, далее с этой полосой можно делать все, что угодно, вырезать из геля, резать следующими рестриктазами и пр.
Все вышесказанное не отменяет того, что я говорил ранее- нужен контроль, что вы опять проигнорировали. Нерезаный контроль. Контроль- это ваше все, особенно на первых порах

Ситуация была хуже, экстра бренды были везде. Я ставила инкубацию 37 - 1 час, почитала на разных форумах, писали, что это может быть incomplete digestion, а ферменты уже не супер свежие, поэтому я увеличила инкубацию до 2 часов и результат вот такой, как я скинула выше. Но все равно меня немного расстроил бенд сверху, поэтому я решила удостоверится. Спасибо за ответ)

это на самом деле, не бэнды, в чем можно легко убедиться, если погнать форез существенно подольше. Ваш целевой рестрикт так и останется единой гомогенной полосой, а все, что сверху, начнет мазаться и выглядеть как высокомолекулярный шмер. Если, к чему я склоняюсь, это геномка (не интактная исходно, разумеется, она изрядно фрагментировалась в ходе выделения плазмиды), то редкощепящими рестриктазами она порезалась, но не в труху, разумеется, а как раз на такие фрагменты, 15-20+ тыс

Я с катсмартом не работал, но, имхо, 2 часа на рестрикцию мало. Это ещё вопрос, сколько Вы плазмиды нагрузили. Поставьте рестрикцию на пол-дня, чего бояться-то? Не будет "недогрыза" уж точно.

+1. Закрывайте тему, у Вас картинка почти идеальная.

Ставьте смело до суток при RT, с 2 единицами каждого, если не уверены. Небовские ферменты, тем более эти два, которые в ходу не зря, не звездят.

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk

https://www.longisland.com/profile/karen88
https://www.mindsumo.com/user/karen-moon
https://clashofcryptos.trade/wiki/Exactly_h...roperty_Details
https://www.kickstarter.com/profile/2010071967/about
https://myemotion.faith/wiki/How_REAL_Maps_...roperty_Details
https://www.pickmonitor.com/user/karen100
https://www.pubpub.org/user/karen-moon
https://devpost.com/admin406
https://wikidot.win/wiki/House_History_Expl...ng_Land_Records
https://www.quia.com/profiles/karen506moon
https://humanlove.stream/wiki/The_particula...ords_Made_Easys
https://www.sqlservercentral.com/forums/user/karen22
https://www.ulule.com/karen174/
https://www.zintro.com/profile/zide0a3888#
http://apnakhata.idea.informer.com/