Комментарии к постоянной странице сайта: PAAG электрофорез белков

Приготовление полиакриламидного геля и электрофорез белков. Выбор % разрешающего геля. Подготовка форезного аппарата. Форез. Хранение гелей.

Хотелось бы уточнить для тех кто делает в первый раз, что pH пятикратного TGB доводить до 8.3 не нужно!

В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3

Laemmli, U.K.

А вот вразумите всё-таки, можно ли сделать готовый раствор для геля (т.е. всё кроме APS+TEMED) и его хранить (в холодильнике, например)? И как долго?

конечно, можно.
Я для своих целей и 15 % разделяющего, и концентрирующий так держу в холодильнике.

только долго хранить его не стоит (более 1 года ) - протухаеть...

бедный робот...

к п 5,8 дегазировать можно как вакуумом, так и продувкой азотом, или инертными газами (гелий), главное избавиться от кислорода, причем продувка быстрее и эффективнее, пузырек с раствором закрывается резиновой пробкой с двумя иголками, конец одной на дно, другой под крышкой, к длинной игле камеру (от мяча, шарик) с азотом (или балон, через редуктор) поток - чтоб еле булькало. (несколько минут и готово) не нужен ни насос, ни мешалка.

Чтоб избежать размывки трэков при внесении проб с высоким содержанием соли либо с ПАВ, полезно с двух боков в лунки нанести чистый буфер для образцов (который добавляли в пробы перед кипячением). Часто это помогает получить более-менее не размытую картинку.

Собственно, готовые SDS-гели можно хранить и при комнатной температуре, предварительно поместив во что-то влажное, например, фильтровальную бумагу, и не давать им высыхать. ДТТ мы храним на -20 сколько угодно, и он не портится.
Например в Германии 10% персульфат аммония принято в виде раствора хранить в морозильнике, хотя принято делать его всегда свежим. Но, видимо, немецкая практика оправдана, потому что гели получаются, сама их заливала.

Уважаемые есть еще такой момент что уж еще раз вспоминая Остермана хочу отметить что ПСА лучше добавлять в растворгеля в последнюю очередь.А с рибофлавином такая штука , он конечно хорош, но летом в холодной лаборатории без света полимеризация занимает гораздо большее время с ним чем с ПСА. И еще просьба вы пишете про выбор концентрации гелей относительно массы белка. Будет лучше если вы еще напишете список этих самых белков с их массами. начинающим будет удобней.

хм... а мы вот 10% APS и вовсе на +4 храним, и довольно долго - работает без проблем.

Коллеги, хотелось бы знать, м.б. кто-нибудь имел дело с разделением водонерастворимых белков. Проблема такая - образец белков, растворенных в мочевине и тиомочевине и после соответственно кипячения в синем буфере и разделения дает очень расплывчатую картину. Много хуже картины водорастворимых белков. В сам буфер мочевину не добавляю.

2 Николай Полянский.

Общая рекомендация такая. Мочевину и ее тио подругу из раствора удалить начисто(например диализом), белки конечно в осадок выпадут, но это не должно вас пугать. Сей осадок надо собрать и как следует покипятить в "синем буфере", белки конечно полностью не растворятся, но львиная их доля растворится, пробу надо отцентрифуговать и отобрать супер его и использовать как пробу.

PS мочевина мешает связыванию SDS с белком, и когда белки выходят из мочевины в SDS то часть из них выпадает в осадок(особенно, если белки сильно нерастворимые и в высокой концентрации) и получаются хвосты.

Полянскому Н. > Мы занимаемся анализом гибридности семян (кукурузы, подсолнечника, ячменя ....). Короче почти все объекты - проламины, за исключением гелиантина подсолнечника. Так вот, если SDS электрофорез не является для Вас критичным, то мы проводим электрофорез в среде таких детергентов как мочевина. Она входит и в состав буфера для растворения и в состав геля. Результаты получаются очень неплохие. Если нужно подробнее, то пишите мне на мейл.

Спасибо. Очевидно, попробую оба варианта.

To: Garry
Мочевина - НЕ ДЕТЕРГЕНТ (т.е. не является "омыляющим" веществом, способным образовывать мицеллы в растворе), а ХАОТРОПНЫЙ АГЕНТ.

Уважаемые коллеги! Поделитесь опытом извлечения белка из ПААГ блока или его фрагментов так, чтобы можно было посчитать С14-радиоактивность в полосках белков (разумеется, они будут вырезаны)

Заранее благодарим.
С наилучшими пожеланиями,
snz@post.nsu.ru

а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?

проще взять аликвоту и высадить тху.....

совсем. гуанидин, в отличие от мочевины, заряжен.

ну да, я просто как-то раз наткнулся на протокол, где его добавляли - в небольших количествах, но гнать потом приходилось на очень маленьком токе.

А вот тогда скажите лучше - что именно выпадает в осадок при добавлении Laemmli к пробе, содержащей GuaCl? Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт? (но если брать избыток SDS, то может, и прокатит?...)

да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?

---Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт?

Если это так то можно, но тогда существует опасность, что и часть белка попадетв этот осадок.

---да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?

Подумайте хорошенько и поймет, что нельзя.

расскажите, пожалуйста, для чего при форезе часто берут вместо второго стекла белую пластину (как она, кстати, правильно называется? алюминий-оксидная?) чем это лучше?
и можно ли этот материал где-нибудь самому достать или купить подешевле? а то покупать фармациевский комплект очень уж долго и дорого...

Это керамика с высокой теплопроводностью - для лучшего охлаждения геля. ИМХО, на фиг не нужна...

"а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?"

если концентрации белка позволяют, то развести образец раз в 10 и можно гнать форез, полосы чуть-чуть будут размыты.
Иначе - метанол-хлороформом высадить, минут 5-20 дополнительных в зависимости от кол-ва проб

Алдер имхо тупо и храбро тху - все.....

Такой вопрос: При кипячении образца в синем буфере образуется углеводная пробка. Как от нее избавится? Говорят, что надо добавить А-амилазу, тогда в какой концентрации, и можно ли ее чем либо заменить?

Ребята, помогите плиз
столкнулась с проблемой: покупаю бисакриламид, мне предлагают диакриламид. есть ли качественная разница (в количестве сшивок и т.д.) между бисакриламидом и диакриламидом?

диакриламид очень сомнительное название. Возможно это димер акриламида, так этот супчик вообще сшивок давать не будет. А то что бисакриламидный аналог без метиленового мостика по идее должен содержать в своем названии слово гидразид и по большому счету довольно экзотичное соединение по сравнению с бисом.

Уважаемые коллеги, нет ли у кого-нибудь опыта "негативного окрашивания" геля с помощью ацетата цинка. Попробовал по описанной методике (Matsui et al.), но применbл не деионизованную воду, а обычный дистиллят. Успеха не имел. Если есть некоторые "хитрости", плз, поподробнее.
Николай Полянский

необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить

необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить

Помогите разобраться. Мне нужно приготовить 1 л TGB готового к применению (я так понимаю 1xTGB). Для этого я беру Tris-base 15.1g + Glycine 94g + 50 ml SDS (http://molbiol.ru/protocol/17_01.html#s1)
А как приготовить 50 ml SDS он в сухом виде. В стоке (кстати что это такое?) SDS 10%, значит нужно на 1 литр взять 100 г SDS?
Объясните пожалуйста поподробней, скажу сразу я не биохимик.

СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....
Делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС
Соответственно сначала растворяите трис и глицин примерно в 900мл воды потом добалвяите 10% сдс и доводите до литра водой....

---СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....

Хе-Хе в электродный я так не делаю не сыплю, а вот во второй раствор для плазмид частенько сыплю сухого. Бо его там в 10 раз больше надо.

--делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС

Истино так. И кстати я его из пипетки прямо в минусовую камеру, для экономии. В два раза меньше расход.

Спасибо за Ваши ответы.
Хотел еще узнать, я использую midi-камеру для электрофореза, мне 500 ml TGB хватит в качестве рабочего объема? И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О, добавляю 50 ml SDS (5g SDS+50ml Н2О) и довожу до 1L Н2О
Глицина не слишком много, половина упаковки приходится высыпать?

я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.

До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?

И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О!

НЕТ НЕ ПРАВИЛЬНО!!!! триса - 3г, глицина-14.4, SDS-1г или 10мл 10% на 1Л готового раствора.

---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
А вот это правильно!!!

---До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?

Что есть 10х SDS в этой фразе? Если вот это: "10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС", то "НЕ ДОПУСТИМ".

что-то я не пойму цели? вам что нужно сдс получить чтоль однократный или все- таки тяжелый буфер??? если однократный тяжелый буфер, то наливаете 100 мл 10х и доводите до 1 литра водой. усё)

Я здесь ошибся "До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?". Имел в виду 10хTGB.

Я вот еще что не понимаю.
В методике PAAG электрофорез белков дана таблица для приготовления TGB - Tris-base 15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?
А вот это тоже правильно?
---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
Получается расхождения по глицину, это не принципиально?

-- трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.

Это правильно. Это исходная система так сказать из первоисточника.

---15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?

Это какая-то модификация с перегрузом по глицину 94 вместо 72.

Вообще говоря, количество глицина весьма принципиально. Но все очень критично, если глицина недоложить и менее критично, если переложить. Небольшой перегруз по глицину позволяет использовать один электродный буфер для нескольких форезов. В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.

Короче, модификация для бедных и ленивых.

Люди добрые, отзовитесь у кого есть в лаборатории PhastSistema, для быстого электрофореза, бьюсь одна, не биохимик, освоила изоэлектрофокусирование, на очереди SDS-электрофорез и 2D-электрофорез, методик нет. Помогите

В раствор для нанесения белка (gel loading buffer
) зачем добавляют Dithiothreitol, он также как меркаптоэтанол востанавливает дисульфидные связи?

->В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.
<-
А если слить весь буфер после фореза и перемешать отношение трис/глицин не выровняется заново?

Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?

1. В принципе да если не боитесь что белки "убежавшие" в нижний буфер Вам помешают поетому обычно фитровал после смешивания....
2. А это зависит от задачи.......