Уважаемые, форумчане,
Кто из Вас работал с культурой человеческих фибробластов, не расскажите чуть-чуть о них, а именно:
1. Сколько времени в трипсине они выдерживают?
2. Сколько раз их можно пересевать?
3. Сколько они могут простоять в чашках без пересева?
4. Какие добавки можно использовать для улучшения их роста и так далее?
5. Какой процент сыворотки и процент CО2 наиболее благоприятны для их роста?
6. Сколько неомицина (ед. активности на мл среды) можно добавлять во избежание пророста?
7. Нет у кого-нибудь каких-нибудь статей по культивированию фибробластов?

Кто-нибудь знает об их использовании в трансплантологии, знаю только про институт Вишневского.

Огромное спасибо!!!
Андрей.

Пусть лучше кто-нибудь скажет как от них избавиться. Не знаю как человеческие фибробласты, но мышиные, если заведуться, то размножаются как тараканы и ничем их не выведешь. Посеешь гибридому, а они тут как тут и давай все лунки заполонять.

Привет Андрей!
1. в 0,25% трипсине - 1-3 мин я держал в зависимости как слезут или на 37оС или в комнатной Т.
2. Если первичная культура, то раз 5-10, потом дохнут.
3. если не делятся, то долго, у меня как-то жили около полугода.
4. не знаю
5. как обычно, 10% пуповинки, 5% СО2
6. добавлял пеницилин/стрептомицин как обычно, без изысков
7. Есть один кудесник в Инст. медгенетики, если хочешь, могу познакомить.
Про транспланталогию, спроси через Илью у Шурика.

Имеем готовую технологию по фибробластам которая прошла клинические испытания и получила патент.
Будем рады сотрудничеству расмотрим любые предложения.
По всем вопросам прошу писать на andre.ru@list.ru

по пункту 5. Неомицин, он же генетицин (G418), это селективный антибиотик, используется для отбора клеток, экспрессирующих трансфицированную плазмиду с неомициновой устойчивостью. Во избежании бактериальных проростов используют либо гентамицин, либо смесь пенициллин/стрептомицин.

трипсин с EDTA

При работе с культурой фибробластов необходимо учитывать, что эти клетки довольно чувствительны к газовому насыщению атмосферы, п.э. не рекомендуется перекрывать им доступ воздуха в культуральной посуде.

ЦИН + ВМедА в Питере - тама в 90-ых работали с фибробластами человека и сажали их на ожоговые поверхности..

Это как понимать? Может по русски изложите, плиз!

Alexey Lomakin: не знаю, не знаю, у нас очень даже благополучно растут в матрасах под резиновой пробкой. Как тут кто-то очень точно выразился - размножаются как тараканы.

To L^2M: К сожалению у нас фибробласты благополучно НЕ растут в матрасах под резиновой пробкой.
Естественно, никто не предлагает их культивировать в матрасике без крышки :-)). Когда потребовалось перевести фибробласты на карантинный режим, мы поставили в инкубатор один матрасик с плотно прикрученной крышкой и неплотно закрытый (для вентиляции). В первом все клетки сдохли. Откуда и был сделан вывод об их "капризности".
Не стоит забывать и о разном поведении "первички" и культуры (штамма, линии).
Мы работаем со штаммами диплоидных человеческих фибробластов кожи,
с мышиными фибробластами линии 10/3,
с линией N-ras трансформированных мышиных фибробластов. И те и другие и третьи требуют неплотного закручивания крышки пластикового матраса, в котором они ведутся.

Alexey Lomakin: у нас первичка и наши производные линии. Люди и мыши.

To L^2M: Привет из лаборатории Ю.М. Васильева.

растим просто - в DMEM (с L-глутамином и высокой концентрацией глюкозы) 10 FCS, антибиотики не применяем - клетки их не любят, а если соблюдать правила стерильности то проблем никаких быть не должно.
Насчёт сосудов - для разгона культуры предпочитаю матрасы с интегрированным в крышку фильтром - и волки целы и овцы сыты

Кстати, если фибробласты покупные, то как правило к ним имеется и вся необходимая информация

А вообще, по моему, фибробласты - самая простая культура из всех возможных. Удачи

чуть не забыл насчёт трипсина - как слезли, так и сейте, как правило 1 - 3 мин. Чем меньше (по времени и по количеству) - тем лучше.

гхйхгхх

в каких пропорциах ви брали трипсин и гхастици кожи

А если культивировать фибробласты экстраэмбриональных тканей зародышей человека? какие должны быть условия? И если нужно получить потомство от одной клетки? При стандартных условиях у нас ничего не получается!

Условия те же самые, эмбриональные фибробласты растут еще охотнее. А потомство от одной клетки вы и не получите. На то они фибробласты, что не образовывают колонии. Чтобы их клонировать клетки должны быть либо стволовыми либо опухолевыми.

Что за бред?????

Вот ссылка правда на мышиные фибробласты, но может чем нибудь поможет
http://www.wicell.org/uploads/media/Protocols_Part_2_05.pdf

+ manual scraper

Ну это если на стекле. А с пластика струей из носика пипетки прекрасно культурур срывает.

Не, не срывает.
У меня (правда не фибробласты, а дедритки)- даже после PBS-EDTA отскр*** из планшетов приходится.

Вот залил один из неплохих протокольчиков по фибробластам, если кому нужно. Там и про establishment первичной культуры и про пересевы.
Брать на Rapidshare здесь:

http://rapidshare.de/files/17901759/Unit_2...ures__.pdf.html

Кстати об отскрябывании manual скреперами...
У меня при отскребании фибробластов сложилось впечатление, что это для них несколько травматично (жизнеспособность ниже оказалась). Не совсем уверен, что это со скрепером связано (от бельгийской фирмы Orange Scientific- рыженький такой, мне показалось, что чуть жестковат), всё ещё проверю.
Если культуру трипсином подольше помучать, то можно почти всё струёй смыть, но тогда на жизнеспособность трипсин начнёт злостнопагубно влиять. Скрепером быстрее, удобнее, но безопаснее ли?

Поделитесь, кто может, своими соображениями на этот счёт.

ну это общепринятый метод в cell culture для детача адгезивных клеток,
я применял для фибробластов, дендритных клеток, стромальных костного мозга -
да в любом случае конечно клетка повреждается - метод травматичен и часть клеток из-за этого обязательно сдохнет (главное чтобы % был небольшой до 5-10),
также повреждают клетку и ферменты - это вещь более тонкая - минуту передержал и дохляка будет ещё больше чем при механическом детаче
поэтому неизвестно что ещё более травматично,
всё это решается индивидуально и зависит-
от типа клеток
количества пассажей, времени культуры
вашего опыта работы с ферментами (речь думаю в основном идёт о трипсин-версене) и их качества
вашего опыта работы со скраперами
качество скраперов и фирмы ставлю на последнее место, тут думаю разброс небольшой- все культуральные брэнды делают более-менее приличные скраперы

я последнее время пользуюсь nunc и очень доволен

По скребкам для фибробластов - небольшая предыстория...

Скребли мы их уже давно (все заказы до нашего захолустья долго доходят, к тому же руководство ещё надо на каждую покупку долго ракурочивать), используя для этого самобытные приспособления. Скребок для клеток при наличии ловкости рук быстро изготавливался из стального однозубого крючка (для трахеостомии используется), на котором закрепляли "лезвие", вырезанное из мягкой силиконовой трубочки. Очень прикольный получался девайс (кому интересно, могу фотографию прислать), бытро, дёшево, сердито, автоклавируемо. И клеточки им снимались мягонько, жизеспособность - как в сказке.
Но вот недавно свершилось (!) - привезли нам, помимо прочего, скребочки заморские оранжевенькие (см. выше). И бросился я ими фибробласты скрести, да вот что-то результат пока восторгов не вызывает... Ещё поколупаемся и, может, к самобытному инструментарию вернёмся...

А, может, нам производство наладить? Будем в Филадельфию контейнеры со скребками экспортировать?

мы тоже самое делали во времена аспирантуры 5 лет назад



истина! зачем тратить деньги на коммерческий продукт, если своё самобытное работает просто супер!

Случайно ни у кого нет лишних L-929?

вопрос ко всем кто в теме - а как мерили жизнеспособность клеток после лифтинга?

Да валяются где-то с давних времен в дьюаре. Могу помочь. Только вот почти уверен, что они с микоплазмой.

Ну не знаю! Наверное, у меня фибробласты lights
Может, пластик такой? Nunc с какой-то там поверхностью, запамятовал. nunclon, что ли...

Скребок для клеток при наличии ловкости рук быстро изготавливался из стального однозубого крючка (для трахеостомии используется), на котором закрепляли "лезвие", вырезанное из мягкой силиконовой трубочки. Очень прикольный получался девайс (кому интересно, могу фотографию прислать), бытро, дёшево, сердито, автоклавируемо. И клеточки им снимались мягонько, жизеспособность - как в сказке.


а можно поподробней? уж больно оно у вас привлекательное получается. хотелось бы попробовать

Приветствую всех, кто интересуется фибробластами, я занимаюсь моделированием поведения фибробластов посредством теории клеточных автоматов и пытаюсь разобраться в следующем вопросе: как фибробласты и коллаены влияют друг на друга в зависимости от угла их взаимной ориентации, как меняется их плотность распределения вследствии переориентации. Кто нибудь может помочь в этом разобраться, или материалы какие-никакие есть, киньте на seregakm@mail.ru.

Хотя вопрос и прозвучал год тому но сразу видно что Андрей собрался выращивать фибробласты. Это не так все просто. Надо набить руку при работе с ними. Хотя кажется все очень просто но реально прауктически фибробласты очень капризные у них ограничен срок жизни, поэтому надо использовать оптимально каждый пассаж.

Верю, но что то все оказалось не просто! Можно ли связатьчя с вами?

Работал с первичными ФКЧ и первичными эмбриональными мыши.
1. Сколько времени в трипсине они выдерживают?
Главное двоекратная отмывка PBS с EDTA или HEPES/EDTA. А затем стандартный трипсин/EDTA в том же буфере. Слетают как миленькие. Не забудьте положить с трипсином в инкубатор. Можно 5-10 минут. Не сдохнут и за 30 минут. Остановка трипсинового переваривания - добавление свежей среды с FCS + 1/4 старой. Не откручивайте.
2. Сколько раз их можно пересевать?
ФКЧ до 17-20 пассажей (стоит работать до 14, после проблемы с цитоскелетом)
Мышиные до 25.
3. Сколько они могут простоять в чашках без пересева?
У первичных контактное торможение. Если меняете среду, как минимум месяц простоят. Но тогда DMEM с малой сахарозой.
4. Какие добавки можно использовать для улучшения их роста и так далее?
Глутамин, 10 % FBS (FCS). Пируват добавлять смысла нет. Они сами синтезируют. 1/4 старой (кондиционированной) среды.
5. Какой процент сыворотки и процент CО2 наиболее благоприятны для их роста?
10% сыворотки 5% CO2
6. Сколько неомицина (ед. активности на мл среды) можно добавлять во избежание пророста?
Неомицин дорогое удовольствие. Обычно пенецилин/стрептомицин и фунгизон (можно гентамицин). Можно работать без антибиотиков (если криворукого колаборатора нет рядом).
7. Нет у кого-нибудь каких-нибудь статей по культивированию фибробластов?
Нет. В статьях пишут как надо было бы... Реально всё по другому. Например, о кондюшке при росте первичных клеток я прочитал, лишь после того как ввёл у себя. Да и то в книге 1962 года!!! Главное набить ручки и иметь учителей Присяжного, ДОНа и Тома.

Резиновый скрабер я даже во Франции ввёл, но для другого. Для снятия фибробластов: это жесткач.
Главное отмывки и 5-10 минут в термостате.
Стоки: морозить в 90% сыворотки 10% DMSO. Поднимать сразу!!! в культуральную среду, без отмывки. Затем через ночь менять среду. Фибробластам DMSO по фигу, не клетки крови.
Работать культуральными пипетками, носиками поменьше (это в книгах не пишут). Если носиками, то только отобрал - добавил, не пипетировать.
Руки мыть с мылом, в боксе не курить и иметь сменную обувь и халат.
Особенно важно, а то некоторые выпускники московских вузов моют стены со спиртом, а руки не моют (у них, цац, кожа сохнет).

иИспользовал кардиоиглу (для больших флаконов сподручнее). На кронцанге. Стериллизовал спиртовым прожигом. Тайгон лучше.

По поводу газовой среды.
Где то была статья про необходимость СО2 для фибробластов.
Впрочем, при нормальной плотности они легко кондиционируют среду. У меня переживали спокойно без СО2 в закрытом флаконе.
Конечно не L929, но назвать суперкапризными не могу. Разве что много пассажей не переносят.

Забыл о трипсине. Берётся коммерческий российский сухой трипсин (покупал в аптеке). Разводиться и фильтруется. Работает мягче коммерческого и более эффективно.

Кто может подсказать как стерилизовать раствор HEPES, кроме стерилизующей фильтрации, подходит ли автоклавирование и в каком режиме???

HEPES при автоклавировании при любом режиме распадается.
Возьмите справочник биохимика и убедитесь.

Подскажите кто-нибудь - если человеческие фибробласты (первичная культура) долгое время (2 недели) стоят без пересева в монослое на обычной среде ДМЕМ (Hyclone) с сывороткой, без смена среды, какие-нибудь процессы, нарушающие целостность белков и ДНК в культуре происходят? Или их можно с чистой совестью вести дальше и затем изучать содержание белков и ДНК?

Заранее спасибо за ответ.

Для первичных фибробластов характерно контактное торможение.
Они у вас в G0 почти все. Стоит пересева два сделать для "обнормаливания" цикла.

Подскажите, пожалуйста, как работать с жидким трипсином после заморозки (сколько времени он стабилен, как фасовать или готовится основной раствор)? может кто работает с антибиотиками: стрептомицин и пенициллин, как их добавить в среду (сразу в среду добавляется или делается концентрированный раствор), как расчитать?

Про трипсин:
http://molbiol.ru/protocol/19_01.html#add
В принципе при - 20 можно и больше года. Фасуйте по 10 мл.

Антибиотики делаете 100 кратный раствор на бессывороточной среде. И фильтруете. Храните на - 20 аликвоты. Считаете по конечной концентрации.