Уважаемые коллеги, может кто-то может подсказать, как правильно работать с ФГА (фитогемагглютинин). Стоит задача сравнить действие цитостатика на лейкозные клетки (К562) с действием того же цитостатика на нормальные мононуклеары, выделенные из крови здорового донора, и стимулированные к митозу с помощью ФГА. Надо ли вносить ФГА заранее, а через какое-то время цитостатик, и надо ли в таком случае перед внесением цитостатика отмыть клетки от ФГА? Или можно вносить ФГА и цитостатик одновременно? Используем среду RPMI 1640 и время инкубации с цитостатиком 96 ч. Порекомендуйте концентрацию и время инкубации с ФГА, необходимые для митогенной стимуляции мононуклеаров. Спасибо.

Клетки от ФГА отмывать не надо.. Дозы ФГА - от 2.5 до 10 мкг/мл...
Вносить ФГА вместе с цитостатиком вряд ли имеет смысл... Думаю оптимальные сроки внесения цитостатика - 2-3 сутки после стимуляции ФГА..

Спасибо. А может тогда порекомендуете что-то по поводу оптимальной методики выделения мононуклеаров (я выделяю на градиенте плотности в фикол-верографине, получается много примесей других клеток) и насчёт оптимальной ростовой концентрации самих мононуклеаров. И вообще, реально ли время инкубации больше 96 ч?

1. А что за клетки оказались в примеси?? Если еще не прочитали - рекомендую обратится к более ранним топикам по проблеме выделения разных популяций клеток по градиенту плотности.
2. 200 тыс клеток будет нормально, но возможны варианты.
3. Насчет времени инкубации - затрудняюсь ответить - в старенькой литературе пишут, что при стимуляции (в т.ч. и ФГА) лимфоциты пролиферируют и не дохнут без IL-2 10-14 суток. Правда подозреваю, что после 6-7 суток им уже плохо.. Думаю стоит все проверить в предварительных экспериментах.

toРомТВ:
То что Вы хотите делать наз РБТЛ -реакция бласттрансформации лимфоцитов.
Выделять надо на фиколл-гипаке (верграфине, уротрасте) d=1,077, стандартной процедурой.
Наличие "других" типов клеток не только не страшно, но и необходимо, без них лимфоциты будут плохо пролиферировать (кроме эритроцитов - их не должно быть, если эритроциты на интерфазе, либо кровь плохая, либо полохо работаете).
ФГА - надо подбирать "оптимальную митогенную дозу", да и вообще Вам еще посмотреть надо, на какой дозе Вы будете тестировать свою бяку, может придется на субоптимальных дозах митогена, или и на суб-, и на оптимальных и высоких дозах, а учитывать площадь под кривой.
Добавлять бяку надо сразу с ФГА - сначала, а потом спустя разные периоды времени - в зависимости от Ваших задач и свойств Вашего соединения.
Отмывать ФГа не надо.
В РБТЛ первый пик пролиферации отмечается к 48 часам, но он маленький, основная масса лимфоцитов пролиферирует к 72-86 часам (за 4-6 часов надо закапать Н3-тимидин), после чего пролиферация заканчиывется и клетки становятся рефрактерными к повторонй стимуляции митогеном.
На 96 часов - какая уж там пролиферация.
Не забудьте проверить свой Н3-тимидин на удельную активность и токсичность для клеток, не забудьте поставить контроли с холодным тимидином.
И еще, если будете работать с донорской кровью, обязательно требуйте справки с печатью и разборчивой подписью того кто делал анализ на СПИД, гепатит и сифилис, чтобы знать потом к кому судебные иски предъявлять на оплату лечения.
Помните, что сцинтилляторы на основе толуола токсичны и канцерогенны - работать надо строго под тягой.

Провели уже первый ориентировочный эксперимент и возникла новая проблема. Клетки были посажены с ФГА в концентрациях 5 и 10 мкг, считались с трипановым ежедневно на протяжении 4 суток. При этом прирост количества клеток был на 4-е сутки не более чем в 1,5 раза или вообще не было. В то же время попадались плотные скопления массы клеток, в которых посчитать клетки было просто невозможно. ЖСП на 4 сутки было примерно 70-80 %. Вопросы:
1. Какой прирост количества клеток и ЖСП можно ожидать в среднем в норме.
2. Какие причины такого результата? Может эти клетки адгезируются на донышках лунок платы и для их отделения недостаточно просто распипетирования? Может им не подходит наша среда (используем RPMI 1640 с 10% FTS, 2 мкг/мл глутамина, пенициллин и стрептомицин стандартно)? Наши К562 при этом растут и делятся отлично.
3. Может применять какой-то другой метод оценки пролиферации клеток? (МТТ?)
4. Что собой могут представлять скопления клеток, о который я говорила выше? Это поделившиеся бласт-трансформированные мононуклеары? Можно ли как-то разбить эти скопления клеток?

Ну вот Вы бы с кем то посоветовались, что ли кто такие вещи уже делал.
Зачем Вам считать трипанкой клетки в культуре?
И как можно сравнивать какую то там К562 - иммортализованную кл. линию. Она потому и растет на спитом чае (зря на нее рпмишку и феталку тратите!), что ей для роста ничего не нужно никаких экзогенных фактров роста.

Пролиферацию МНК в культуре меряют по уровню синтеза ДНК пределямого по включению н3-тимидина, а не по приросту кол-ва клеток, как Вам хочется т.е. попроще и малой кровью.
А то что клетки в культуре склеиваются и дохнут, так так и должно быть ФГА он на то и агглютинин, чтобы "клеить".
И не верьте сказкам про ММТ, все равно, правильно не сделаете, будете только мучиться и потом страдать с полученными результатами.

Огромное спасибо всем! А всё-таки, во сколько раз можно достигнуть прироста клеток в результате РБТЛ, примерно?

РомТВ!
Опять 25.
Еще раз и последний объясняю.
Не определяется "количественно прирост клеток" в РБТЛ. Культура МНК стимулированных ФГА это "черный ящик". Вы сажаете в культуру опред. число МНК, но там и нейтрофилы и моноциты. и эозинофилы. и фиброблоасты и ДК и все это стимулируется ФГА. Часть клеток гибнет. часть активируеться и начинает синтезировать ЛНК. часть вдоходит до митоза, часть его проходит и т.д. и т.п.
кто и как, что и скольео, кто погиб, кто выжил, кто поделился - выяснить невозможно. Единственный критерий пролиферации синтез ДНК, опр. по включению радиоактивной метки Н3-тимидитна.

Ведь даже когда еще учитывали РБТЛ морфологически (ЭТО относительный, в процентах показатель), считали клетки по градациям =
-активированный большой лимфоцит,
лимифобласт,
бласт,
митоз

Почитайте литературу, обратитесь к специалистам, поучитесь, предложите им коллаборацию.

PS. Вы часом не в коммерческой фирме работает? Очень подозрителен уровень ...

фиброциты

Не буду спорить, я не слишком хорошо пока ориентируюсь в данной области, с кровью раньше не работала. Но что вы скажете о следующей работе
ссылка: http://www.jlr.org/cgi/content/full/40/7/1200 (статья называется Oxidized low density lipoproteins induce apoptosis in PHA-activated peripheral blood mononuclear cells and in the Jurkat T-cell line )
Тут они и с трипановым, и МТТ тест использовали и с флуоресцентными красителями работали (наряду с тестом на включение Н3 тимидина). Вы считаете, эта работа недостаточно компетентна?

Как бы Вам это помягче сказать?
Мне кажется, у Вас и Вашей лабы все это еще впереди, когда Вы все станете компетентными к воспроизведению-повторению работ такого уровня.
Не исключено. конешно что я ощибаюсь. та как вы очень здорово маскируете свой экспириенс и потенциал!
Желаю успеха!

МТТ- хороший метод, ежели нет ничего другого ( дабы хоть чтот-то качественно оценить).
Но лучще - CFSE, BrdU и тимидин, как конфирмацию.
А равно же- активационные и прочие маркеры посмотреть. И true-count прогнать по сабсетам.

Дядя ФАКСер, большое спасибо за совет и поддержку!

Дык- не за что.
Сам пролиферацию с МТТ смотрел, когда с реактивами жопа в 1998 году была...

Как сохранить цитоплазму лимфоцитов после их культивирования с цитохалазином В и фиксацией в 3:1 метанол-уксусная к-та - окрашиваются одни ядра

ЧЕМ окрашиваются?

А как Вы уваемый(ая)мазки делаете Лф после культивирования? ЗАдача не то что нетривиальная, а уметь надобно. Да так чтобы клетки целиком сохранились. Ядра товсегда получались, ОНи от цитоплазмы после культивирования и активации легкоооо отделялились.
Так как Вы это делаете?
А Цитохолазин и фиксация, здесь не причем!

спасибо! я имел в виду , что после фиксации метанол-уксусная к-та 3:1 теряется цитоплазма.Может быть ,уважаемые коллеги кто нибудь подскажет другой фиксатор.

никуда она не теряется от фиксатора

как это не теряется. если на препарате ее нет . только ядра? Хорошо,дорогой гость ! Скажите пожалуйста, если вы знаете,как сохранить клетки целиком , после фиксации мет.-ук.(3:1)_.Буду очень вам благодарна!!! Пардон! Какой краситель используете? спасибо!

как это не теряется. если на препарате ее нет . только ядра? Хорошо,дорогой гость ! Скажите пожалуйста, если вы знаете,как сохранить клетки целиком , после фиксации мет.-ук.(3:1)_.Буду очень вам благодарна!!! Пардон! Какой краситель используете? спасибо!

Это гость 1-й

А это гость 2-й. И правильно пишущий.

А это - tissengineer, ругающийся и требующий зарегиться гостей! Нада его в англицкое посольство направить!

А как Вы препараты делаете, так, что у Вас цитоплазма отскакивает?
И одни ядра остаются. Здесь науки нет . С клетками надо работать gentle! и все дела. Из культуры, после вашего цитохолазина, осадитее клетки мягким центрифугированием, желательно прямо в культ. среде куда Вы добавляли свой цитхолазин. 500 об на ОПН-ке. минут 8-10. Так чтобы они не слиплись.
Убрать супернатант. Перенесите клетки в маленьку, тонкую, тоньше эппендорфа пробирку, лучше сделанную из пастерки стеклодувом. Добавьте сыворотуку и мягко (gentle!) ресуспендируйте и центрифугируйте при мин оборотах -200-300-500. Эту маленькую пробирку луше вставить в центрифужку, ну и сделатьдля нее что то типа футляра из поролона полипропилена, что бы она ровно в центрифужке стояла. Отфугуете и тонкой пастеркой оттянутой на горелке, или очень тонким и длинным типсом для авт. пипетки (научиться надо!) отбираете супернатант, а затем клетки ресуспендируете в оставленном Вами минимальном количестве сыворотки.
И капельку переносите на предметное стекло. Фиксатор можно добавить заранее в культуру, а можно фиксировать мазок. Клетки теряют цитоаплазму , большей частью, когда Вы их по стеклу размазываете. Так что учитесь делать мазок.

Огромное спасибо Гость(извините 1или 2?) Я понимаю, что здесь науки нет. Поэтому и обратилась с вопросом. Теперь вижу , в чем моя ошибка, слишком большие обороты(600-1000). Остальное ,делаю также, только перед фиксатором добавляю гипотонию(КCL-0,56%). СПАСИБО!