Долговременное хранение оправдано для (i) коллекционных культур и для (ii) штаммов-продуцентов. Для последних, кроме коллекционных пробирок имеет смысл готовить серьёзные аликвоты для выращивания (часто эти штаммы нестабильны и приготовить сток аликвот значительно проще, чем каждый раз контролировать эффективность экспрессии).
На -70oС (неограниченное время)
Приготовление стока
вырастить ночную культуру (можно с антибиотиком);
5-15% глицерин:
перенести 850µl культуры в пробирку с 75-150µl глицерина;
7% DMSO:
перенести 930µl культуры в пробирку с 70µl DMSO;
смешать, заморозить в жидком азоте;
хранить на -70oС неограниченное время.
Высев клеток из -70oС стока
NB!!!Во время высева пробирка с клетками должна постоянно находиться в жидком азоте.
раскалить петлю на пламени горелки;
воткнуть в культуру, дать ей вмёрзнуть;
выдернуть петлю из пробирки вместе с несколькими микролитрами намёрзшей культуры;
перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко;
простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов;
сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.
В анаэробных условиях в столбиках (до года)
Приготовление стока
разлить по ~1.2ml агара (без антибиотиков) в 2ml пробирки с завинчивающимися крышками;
снять петлёй бактериальную колонию (или обмакнуть петлю в ночную культуру);
2-3 раза воткнуть петлю в столбик;
плотно завинтить крышку, хранить в темноте при NT.
Высев клеток из столбика
воткнуть стерильную петлю непосредственно в культуру столбика;
перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко;
простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов;
сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.
Новый "фирменный" штамм используется (без размораживания) только для создания -70oС стока: высеять штрихом, поставить 5 ночных культур (3 - из различных индивидуальных колоний, 2 - из массы колоний), далее начиная с "п.2.".
Хранение в столбиках имеет смысл использовать только для транспортировки клеток при комнатной температуре.
Весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных бактериальных клеток, то беспокоится не о чем.
По пунктам
п. 2.
Глицерин и DMSO предотвращают образование больших кристаллов воды, которые разрушают бактериальные клетки.
Нам больше нравится метод, использующий DMSO, т.к.
(i) его (DMSO) нет нужды стерилизовать,
(ii) глицерин вязкий, фасовать приходится на весах.
Очень хорошая альтернатива в случае большого количества пробирок - добавлять к 500µl культуры 500µl среды с 30% глицерином.
Можно разаликвотить глицерин (или DMSO) заранее и хранить при NT (+4oС), соответственно.
п. 5.
Нам больше нравится, когда петля платиновая.
Мы стерилизуем петлю следующим образом:
стерилизация:
раскалить петлю до красна на пламени горелки;
охлаждение:
погрузить проволочку (но не её держатель) в спирт;
быстро провести над горелкой (что бы спирт загорелся);
охладить на воздухе ~2'. Если охлаждалось меньшее время, можно перед тем, как забрать колонию прижать петлю на 3-5'' к свободному от бактерий участку агара на чашке (смысл процедуры в том, что на воздухе раскаленная до красна петля остывает довольно долго. В спирте - быстрее. Конечно, при сгорании спирта она нагревается вновь, но уже не так сильно).
пп. 9, 10
Удобнее стерилизовать две петли, и работать одной, пока вторая остывает после стерилизации.
Штриховка - чтобы разбавить плотную смесь до отдельных клеток.
Дополнения, комментарии, вопросы
AnKri/11.11.2005 13:11/
Как правильно заморозить на -80С споры бактерий и грибов, если до этого они находились в физрастворе в обычной морозилке?
Lil/27.06.2006 20:02/
Простите за дурацкий вопрос: как глицерин стерилизуют?
Viktoria1510/27.06.2006 20:16/
50-80% глицирин стерилизуют автоклавированием
Гость/06.07.2006 21:12/
Может кто-нибуть просветит, что происходит с клетками при -196 и как их потом лудше вывести из такого состояния? Или поделится инф о какой-нибуть новой хорошей литературкой по этой теме...
Atropos/04.03.2007 19:24/
Вопрос про замораживание штаммов с плазмидами:
(Novagen's pET manual)
Note that high glycerol concentrations (> 10%) may lead to plasmid instability.
А почему так происходит? У нас в лаборатории их вообще при 20% до сих пор хранили...
Guest/05.03.2007 12:28/
А в какой это инструкции? Что-то раньше вроде не замечал этого пункта.
Atropos/05.03.2007 13:12/
(Guest @ 05.03.2007 12:28)
А в какой это инструкции? Что-то раньше вроде не замечал этого пункта.
C. Storage of Strains Permanent stocks of hosts and pET recombinants are best kept as glycerol stocks. Note that high glycerol concentrations (> 10%) may lead to plasmid instability.
Гость/09.01.2008 13:23/
Дорогие коллеги. Можно ли высевать клетки из музея (с - 70)сразу на ночную культуру, минуя стадию рассева на чашку? Чем это хуже? Клетки - E. coli, несут плазмиду с аб-устойчивостью. Спасибочки.
Гость/11.02.2009 02:32/
Какая-то туфта. Столбики какие-то. Нестабильность. А если азота нет, повеситься, что ли? Вы что там, тысячелетиями собираетесь свои клоны хранить, для благодарных потомков? Какой-то вчерашний андеград чето-то там напортачил в Новамеде, а тут уши развешивать. Глицерин просто разведите до 50% сразу, тогда легко его раскапывать. Храните замороженым. Ваще у всех свои методы, я, например, ресуспендирую в свежой среде с глицерином 20% и замораживаю на -70. Если нет -70 то и -20 сойдет на несколько лет точно. Да, можно без всякой чашки, сразу в бульон высевать.
MolBiol.ru >
Методы >
Бактерии > Хранение бактериальных штаммов
ZBIO
Дополнить
