Приготовление компетентных клеток

1. со стока (-70^oC) рассеять бактерии петлёй на пробирку с LB;
2. выращивать 37^oC, ON, интенсивно встряхивать (200-300rpm);
3. пересеять ночную культуру 1:100 на жидкую среду LB, содержащую дополнительно 20mM глюкозу и 10mM MgCl₂, и растить при 37^oC и интенсивном встряхивании (200-300rpm) до OD₆₀₀= 0.30 ÷ 0.35.

все дальнейшие манипуляции проводить на холоду

4. поместить в пробирку эппендорф 1ml культуры;
5. 0^oC, 5-10';
6. ЦФ 3.5÷4.0 kg 4^oC, 5', слить супернатант;
7. ЦФ 3.5÷4.0 kg 4^oC, 20'', тщательно удалить остатки жидкости;
8. ресуспензировать в 12µl LB, содержащего 20mM глюкозу и 10mM MgCl₂;
9. добавить 13µl 2xTSS, несколько раз пипетировать;
10. заморозить (в сухом льду/этаноле или жидком азоте), хранить в на -70^oC;

Контрольная трансформация

1. оттаять во льду аликвоту компетентных клеток;
2. добавить ~1µl (10-100ng) pDNA, 2-3 раза аккуратно пипетировать;
3. 0^oC, 10-15';
4. 42-43^oC, 30'', без встряхивания;
5. сразу в лед, 2';
6. + 1 ml LB; 37^oC, 40-60';
7. ЦФ 3.5-4.0 kg 4^oC, 5', слить супернатант не очень тщательно, ресуспензировать клетки и высеять 1/10 на одну чашку с антибиотиком, 9/10 на другую.

Реальная трансформация

1. аналогично "контрольной";
2. на одну аликвоту можно брать pDNA в объёме до 4µl;
3. высев - в зависимости от задачи;