двукратное равновесное центрифугирование лямбда в градиенте плотности CsCl. Нужно обязательно ориентироваться по метке между p =1.5 и p =1.45 т.к. в пробирке будут и другие опалесцирующие слои.
п. 23, 25.
Можно прерваться, оставив суспензию фага на несколько суток при+4oС.
п. 26.
CsCl нужно убрать потому, что высокая концентрация соли ингибирует работу Proteinase K.
Бактериофаг лямбда можно хранить в CsCl при +4oС несколько лет.
п. 30.
Вместо переосаждения применяется диализ т.к. DNA фага длинная и может при переосаждении рваться.
п. 33-38.
Мы не можем уверенно сказать, какая из процедур дает вектор более высокого качества - дополнительные экстракции и переосаждения на пользу DNA не идут.
п. 33.
Очистка от рестриктазы.
п. 38.
Mg+ требуется для нормального отжига.
п. 39, 40.
Отжиг плеч фага лямбда. На концах лямбда имеются 12-членные одноцепочечные комплементарные участки. Во время отжига эти участки слипаются, соединяя левые и правые плечи.
п. 41.
Дефосфорилирование. Если вы действительно хотите получить вектор высокого качества, фосфатазу неплохо было бы откалибровать:
дефосфорилировать различным количеством CIAP ~0.2 µg векторной DNA линеаризованной той же рестриктазой, что и лямбда-вектор;
переосадить;
для каждого образца поставить два лигирования:
на себя,
с 3х кратным избытком недефосфорилированной плазмиды (лучше другого размера);
прогнать результаты лигирования на форезе. Оптимальная концентрация CIAP должна предотвращать лигирование на себя, но не ингибировать лигирование с 3х кратным избытком недефосфорилированной плазмиды.
MolBiol.ru >
Методы >
Фаг лямбда > Выделение ДНК (качественное)
Zbio-wiki
Дополнить