Главная страница MolBiol.ru > Методы > Фаг лямбда > Вырезание плазмиды in vivo Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

In vivo выщепление pSK(-) из лямбда ZAP

 

    1ыйдень

  1. выколоть бляшку лямбда ZAP, поместить её в пробирку с SM/хлороформ (500µl/20µl), вортекс;
  2. качать 1-2h NT или без качания +4oC, ON;
  3. приготовить ночные культуры (бактериальная качалка 200-300rpm, 30oC, ON):
  4. XL-1Blue (3ml LTB/Mg/мальтоза),
    SOLR (3ml LTB);


    2ойдень

  5. в 1.7ml пробирку поместить:
  6. 200µl культуры XL-1Blue,
    25-250µl фаговой суспензии из п.2,
    > 106pfu ExAssist фага-хелпера (обычно 1µl из стока);

  7. 37oС, 15', без встряхивания;
  8. перенести в 3ml LB;
  9. бактериальная качалка 200-300rpm, 37oС,>2-2.5h;
  10. 1.2ml -> в 1.7ml пробирку;
  11. 70oС, 15';
  12. ЦФ 5';
  13. 100µl супернатанта перенести в пробирку с 200µl SOLR;
  14. 37oС, 15';
  15. высеять 10-50µl (неравномерно!!!) на чашку LB/Amp+Kan.


  16. Упрощённый вариант метода

  17. из ночных культур XL1-Blue и SOLR приготовить Bacterial Mix (BM):
  18. XL1-Blue + SOLR + ExAssist =1:1:~108pfu/ml;

  19. смешать в одной пробирке:
  20. 5 µl суспензии фага лямбда,
    195 µl BM;

  21. 37oС, 15', без встряхивания;
  22. бактериальная качалка 200-300rpm, 37oС, ~2h;
  23. высеять 10-50µl (неравномерно!!!) на чашку LB/Amp+Kan.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 8328

    Растворы

    SM

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaCl100mM5M1.0ml
    Tris Cl pH8.050mM1M2.5ml
    MgCl210mM1M500µl
    Gelatin0.01%2%250µl
    H2O mQ45.75ml


    Комментарии

    Общие

  • Область начала репликации одноцепочечных бактериофагов можно разделить на две части: 1) сайт инициации, 2) сайт терминации синтеза DNA. В векторе лямбда ZAP эти сайты клонированы раздельно и содержат внутри себя последовательность pSK(-). Фаг-хелпер проводит выщепление фагемиды pSK(-) из лямбда ZAP, ее упаковку и секрецию в среду. Штамм SOLR устойчив к инфекции фагом лямбда. Он так же не способен комплементировать амбер-мутацию фага ExAssist. Без этой супрессии ExAssist не способен осуществлять свою репликацию. Т.о. в этих клетках могут размножаться только фагемиды pSK(-).


  • По пунктам

    п. 1, 2.

  • Элюция лямбда ZAP в SM.
  • п. 3.

  • XL1-Blue - с чашки LB/Tet. (Tet.: 12.5µg/ml => 2.5µl/ml стока 5µg/µl);
  • SOLR - с чашки LB/Kan. (Kan.: 50µg/ml => 0.5µl/ml стока 100µg/µl).
  • Обе культуры можно хранить при +4oС в течение недели.
  • п. 4, 5.

  • Клетки XL-1Blue заражаются лямбда ZAP и одноцепочечным фагом-хелпером ExAssist, инкубация без встряхивания на 37oС в п.5. требуется для заражения фагом лямбда.
  • п. 7.

  • Фаг-хелпер проводит выщепление фагемиды pSK(-) из лямбда ZAP, ее упаковку и секрецию в среду.
  • п. 9.

  • Тепловая обработка убивает все клетки E. coli, на фаги она не действует.
  • п. 10.

  • Осаждение погибших клеток. В супернатанте остаются: выщепленная фагемида, фаг-хелпер, фаг лямбда ZAP.
  • п. 11.

  • Штамм SOLR обладает забавным свойством: плазмидная DNA, полученная из этого штамма образует широкий спектр конкатамеров. Эта особенность способна вызвать замешательство при сравнении ее на электрофорезе с pDNA, выделенной из таких штаммов, как DH10B, XL1-Blue.
  • п. 13, 18.

  • На этом этапе можно добавить в среду глицерин до 7.5-15% и хранить клетки при -20oС (а лучше при -70oС).
  • Селекция на Amp отбирает клетки, несущие pSK(-). Высев должен быть чрезвычайно неравномерным, т.к. обычно вырастает очень много колоний.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler