MolBiol.ru > Методы > ДНК из геля > С помощью PEG/TAE | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
Выделение ДНК из агарозного геля с помощью PEG/TAE
обычно дальнейшая очистка не требуется, для каких то "особо чистых" случаев: 1/10V 3M AcONa,
п. 1.
п. 4. п. 5. п. 8, 9. Дополнения, комментарии, вопросы _Артем_ /11.01.2006 03:44/
п.1 При концентрации PEG 17% можно не пользоваться фитилями, так как раствор довольно вязкость и при аккуратном наслоении остается таковым при ЭФ. Вязкость PEG сильно зависит от температуры и при необходимости ЭФ можно проводить при пониженной температуре. Atropos /03.11.2006 20:12/
Guest /04.11.2006 10:23/
методэлюции из геля , описанный Guest /04.11.2006 10:30/
метод элюции из геля , описанный выше а) трудоемок крайне б) грязен в смысле кросс-контаминации при выделении более 1 фрагмента в параллель в) с трудом справляется с разделением и элюцией одной из дву-трех близко идущих полос И потом, оценка повреждения ДНК при облучении зависит, кроме длины волны и размера фрагмента, еще и от времени облучения, расстояния от лампы до геля и тп- что очевидно, не сам свет плох, а количество поглощенных фотонов. Ну и про последнюю статью- смешно, как 99% всего, что сливается в Biotechnique, ей-богу. МОжно много чего налить в буфер (как в бензин!)- может, просто научиться работать быстро , чисто и не повреждать ДНК ультрафиолетом, а мозги- чтением бредовых методик и статей?! Platov /14.12.2006 01:24/
Guest, a какой метод предлагаешь ты? Guest /14.12.2006 15:51/
(Guest @ 04.11.2006 09:30) метод элюции из геля , описанный выше а) трудоемок крайне б) грязен в смысле кросс-контаминации при выделении более 1 фрагмента в параллель в) с трудом справляется с разделением и элюцией одной из дву-трех близко идущих полос И потом, оценка повреждения ДНК при облучении зависит, кроме длины волны и размера фрагмента, еще и от времени облучения, расстояния от лампы до геля и тп- что очевидно, не сам свет плох, а количество поглощенных фотонов. Ну и про последнюю статью- смешно, как 99% всего, что сливается в Биотечнияуе, ей-богу. МОжно много чего налить в буфер (как в бензин!)- может, просто научиться работать быстро , чисто и не повреждать ДНК ультрафиолетом, а мозги- чтением бредовых методик и статей?! А можно работать МЕДЛЕННО И не суетиться зазря И не ОБЛУЧАТь ДНК улътрафиолетом сдуру mega monster kill /15.12.2006 20:08/
Никаких методов ваще не надо для агарозы. Берете полосу из геля, замораживаете вместе с гелем и пропускаете через фильтр 0,2-0,4мкм и т.п. например ацетат целлюлозы, или любой другой low binding. ВСЕ!!!!!!!!!!! curious67 /16.12.2006 22:51/
а зачем тогда киты для выделения из геля? А куды деваться от кусков (маленькие- но все же) агарозы- она отлично ингибирует все подряд, начиная с лигирования Guest /19.07.2007 15:28/
(curious67 @ 16.12.2006 22:51) а зачем тогда киты для выделения из геля? А куды деваться от кусков (маленькие- но все же) агарозы- она отлично ингибирует все подряд, начиная с лигирования из агарозы естъ КлонВелл - НИЧЕГО ВЫРЕЗАТь НЕ НАДО Alexkiev /23.07.2007 12:55/
mega_monster_kill, а каими последствиями чреват такой метод? для чего замораживать гель с ДНК, разрушить? ДНК выходит через гель с TBE? Как потом будут вести себя рестриктазы в этом буффере? Guest /23.07.2007 17:31/
(Alexkiev @ 23.07.2007 12:55) мега_монстер_килл, а каими последствиями чреват такой метод? для чего замораживать гель с ДНК, разрушить? ДНК выходит через гель с ТБЕ? Как потом будут вести себя рестриктазы в этом буффере? тут полоска приходит в ЛУНКУ с ВОДОЙ когда видищ что уже продукт подошел к лунке в геле - Просто добавь ВОДЫ Alexkiev /25.07.2007 14:51/
тут полоска приходит в ЛУНКУ с ВОДОЙ когда видищ что уже продукт подошел к лунке в геле - Просто добавь ВОДЫ Вариант неплохой, но прибор... Все равно спасибо, подкоплю денег и... Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации...? Скорее всего малая концентрация. Спасибо Alexkiev /27.07.2007 12:47/
Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо Ъ /27.07.2007 15:31/
(Alexkiev @ 27.07.2007 12:47) Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо Ваши ближайшие цели? Иначе быть пожару на Вашем рабочем месте. Я мею ввиду пожар в виде контаминации ПЦР продуктом. . Alexkiev /30.07.2007 11:06/
Да насчет ПЦР, это просто интерес, слишком мало продукта получилось из вставки, хотя саму вставку до реакции на форезе вообще видно не было. Вставка была около 1нг в 1мкл... Нет смысла элюировать из геля, да и другими способами, больше потеряю чем выделю. А вот по поводу амплификации плазмиды, а не вставки, это серьезно. Я уже решил порезать ее и использовать кусок со вставкой для амплификации, а не целую. Что думаете? Ъ /01.08.2007 16:53/
(Alexkiev @ 30.07.2007 11:06) Да насчет ПЦР, это просто интерес, слишком мало продукта получилось из вставки, хотя саму вставку до реакции на форезе вообще видно не было. Вставка была около 1нг в 1мкл... Нет смысла элюировать из геля, да и другими способами, больше потеряю чем выделю. А вот по поводу амплификации плазмиды, а не вставки, это серьезно. Я уже решил порезать ее и использовать кусок со вставкой для амплификации, а не целую. Что думаете? Если у Вас выход ПЦР продукта низкий, это не по причине что Вы взяли в качестве матрицы вставку (это ПЦР продукт?) или плазмиду. Для ПЦР эти количества матриц практически одно и то же. Теоретически, линейка-плазмида лучшая матрица, но проблема Ваша в самой ПЦР - низкий выход из-за плохо оптимизированной смеси. Оставьте плазмиду и вставку в покое и ищите причину в другом, начиная со структуры праймкров (нет ли ошибок). Происхождение Ваших реактивов и, вторично, Ваши ближайшие цели? guеst /01.08.2007 17:21/
(Alexkiev @ 27.07.2007 11:47) Может, если перебухать фермента и поставить неоправданно большое время элонгации (минуты две). Вы ничего не написали о вашей амплификации. На основании такой информации никто Вам помочь не сможет. Если наугад, то чаще всего "низкий выход" получается, когда людям требуется амплифицировать сравнительно короткий фагмент, но они берут "обычную" концентрацию праймеров. Alexkiev /02.08.2007 15:08/
Реактивы кваген и ферментас, есть свое, собственноручное. Вставка ок.200 п.н. Цель получить транскрипт. Вставка кодирует тРНК, мутантную (узнается как пролиновой, так и аланиновой АРСазой). Проблема с праймерами, возможно, потому что разн. темп. плавления, но всего 2 градуса. А скорее из-за того, что разное соотношение GC, считывание полимеразой начинаеться у одного праймера с Т, у другого с А ( по-разному садиться). Время элонгации 1 мин,30 циклов ( вряд ли влияет), температура отжига 58 град. при темп. их плавления 68-66, но так сказали.) Больше ничто не может влиять. Фермента не много, праймеров больше чем в методике с molbiol. Спасибо Кстати насчет перебуха - верно, но после нескольких казусов в таком состоянии на работу не прихожу Ъ /03.08.2007 15:57/
Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. Guest /03.08.2007 17:27/
(Ъ @ 03.08.2007 15:57) Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. Сегодня около Венеции- погода дер;мо- рву -Миласн-Генуя Guest /03.08.2007 17:29/
(Ъ @ 03.08.2007 15:57) Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. Привет Ты еше не охерел Guest /03.08.2007 17:34/
(Ъ @ 03.08.2007 15:57) Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. НУ ИЗВИНИ - из италии приходится мессаги кидат завтра рвану на другой берег Ъ /03.08.2007 20:15/
(Guest @ 03.08.2007 17:34) Я думал, что ты давно загораешь. Привет. А я уже загораю на том же месте, где и был на майских, на острове в Средиземном. Это к юго-востоку от тебя. watchesonline89 /21.12.2022 09:00/
|
Смотри также: /ссылки на сетевые ресурсы/
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|