Главная страница MolBiol.ru > Методы > ДНК из геля > С помощью silica spin колонок Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · БИОХИМИЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · ТУРИЗМ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · ZBIO

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью silica spin колонок

Чуть более удобный способ, чем очистка на silica particles, так как не приходится беспокоиться о том, чтобы не повредить осадок частиц. Можно чистить как двухцепочечную, так и одноцепочечную DNA.
  1. вырезать фрагмент DNA и взвесить получившийся кусочек агарозы (100mg=100µl);
  2. добавить к нему 4х кратный объём буфера AB(или NIB);
  3. инкубировать ~10' при 50оС перемешивая время от времени;
  4. когда агароза растворится проверить цвет раствора и довести pH, если необходимо;
  5. добавить объём изопропанола, равный объёму геля, смешать;
  6. нанести на колонку (ЦФ 1 – 2');
  7. промыть колонку 400µl AB(или NIB) (optional, отмывка от остатков агарозы);
  8. дважды промыть колонку 400µl WB;
  9. убрать элюат из 2ml пробирки-резервуара и высушить колонку ЦФ 2';

  10. элюция DNA:
  11. поместить колонку в чистую 1.5ml микроцентрифужную пробирку;
  12. нанести на колонку ~30µl EB, инкубировать >1';
  13. центрифугировать 2'.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 7731

    Растворы

    AB (adsorbtion buffer)

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    MES, pH 5.550mM1M0.5ml2.5ml
    EDTA, pH8.020mM0.5M0.4ml2.0ml
    Triton X-1000.5%10%0.5ml2.5ml
    Cresol red0.05mM50mM10µl50µl
    H2O mQ4.09ml20.45ml

    MES, pH 5.5, 1M

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    MES (Na)1M217.2g/M2.17g10.86g
    Укс. к-та (лед.)853mM17.4M0.49ml2.45ml
    H2O mQ   

    WB

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    Этанол80%100%8.0ml40.0ml
    TrisCl, pH7.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ1.9ml9.5ml

    EB

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    TrisCl, pH8.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ9.9ml49.5ml


    Комментарии

    Общие

  • Изготовление silica spin колонок описывается в протоколе "Очистка pDNA на silica spin колонках". Там же описаны проблемы, которые может вызвать очистка на стеклянных мембранах (ингибирование некоторых ферментов).
  • Принцип метода: агароза растворяется в GuSCN (или NaI), ДНК обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются GuSCN и 80% этанолом, и очищенная DNA элюируется в буфере с низкой ионной силой (годится для сиквенса и практически всех других применений).
  • Практически все методы работы на silica spin колонках с минимальными модификациями адаптируются для "silica particles (glass milk)" или "diatoms" и наоборот (единственное серьёзное преимущество стеклянных мембран перед частицами — нет нужды беспокоится о сохранности осадка).
  • Все промывки можно проводить не только на центрифуге, но и с помощью вакуумной промывалки.

  • По пунктам

    п. 2.

  • Вместо буфера на основе Guanidine isothiocianate, можно использовать буфер на основе NaI, который тоже растворяет агарозу. NIB: 6.6M NaI, 16mM Na2SO3, 0.05mM Cresol Red (хранить в темноте при 4oC)
  • п. 4.

  • Крезоловый красный введён в AB как краситель, изменяющий цвет в зависимости от pH: жёлтый при pH<7.5 и красный при pH>7.5. Дело в том, что связывание ДНК с мембраной резко ухудшается при pH>7. Если цвет смеси (п.1) оказался оранжевым или фиолетовым, следует уменьшить pH добавив немного 3M ацетата натрия, pH 4. Крезоловый красный можно не добавлять, если протокол очистки уже оптимизирован для конкретного буфера.
  • п. 8.

  • WB. Это - забуференный 80% этанол. Он используется для того, чтобы отмыть мембрану от хаотропных солей. Tris — необходимый компонент WB, так как чистый 80% этанол денатурирует двухцепочечную ДНК во время промвки.
  • п. 11.

  • EB. Низкосолевой буфер с pH в районе 7.0 - 8.5. В принципе, можно использовать просто воду, но нужно убедиться, что её pH находится в указанных пределах.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Poltavets /15.06.2006 14:43/
    Хотелось бы попробовать применить этот метод для очистки матрицы перед сиквенсовой реакцией. Нашла еще один похожий протокол, но там требуется MES-кислота и соль Na.Где бы раздобыть немного чтобы попробовать?



    Poltavets /15.06.2006 14:47/
    Хотелось бы попробовать применить этот метод для очистки матрицы перед сиквенсовой реакцией. Нашла еще один похожий протокол, но там требуется MES-кислота и MES-соль Na.Где бы раздобыть немного, чтобы попробовать? Коллеги, поделитесь опытом, как дешево и качественно чистить ПЦР-продукт. Заранее благодарю за добрый совет!



    Lesha /15.06.2006 15:43/
    (Poltavets @ 15.06.2006 13:47)
    Ссылка на исходное сообщение  требуется MES-кислота и MES-соль Na


    Это просто буфер. Годится практически любой (т.е., фосфат я бы трогать не стал smile.gif ), который держит буферную емкость в этом диапазоне pH



    Demyanov /20.06.2006 19:36/
    MES вроде обычно нужен для того, чтоб сделать концентрированный гуанидин. Я как-то покупал MES у Хеликона. Еще есть готовые отечественные наборы, которые могут подойти для вас см. ссылку

    http://cytokine.ru/gate.html?name=Content&pa=showpage&pid=13 ( http://cytokine.ru/gate.html?name=Content&pa=showpage&pid=13 )



    Chlorum /20.06.2006 23:51/
    А разве нельзя выгонять ДНКу из геля центрифужными методами? Я не нуклеинщик, поэтому вопрос наивный, но читал в некоторых спецификациях, с которыми жизнь сводит...




    Invision Power Board Database Error  

    There appears to be an error with the database.
    You can try to refresh the page by clicking here.

    Error Returned

    We apologise for any inconvenience




       
Дата последней модификации: 15/06/06

ГЛАВНАЯ · БИОХИМИЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · ТУРИЗМ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · ZBIO

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  PlastMarket - продажа комплектующих для производства окон в Украине  · 
--- сервер арендован в компании euhoster.ru, Финляндия, г.Хельсинки ---
 ·  Slando - объявления о работе в Киеве и Киевской области  ·  Купить bluetooth гарнитуру на SotMarket.ru  ·  Купить аксессуары для ноутбуков и нетбуков оптом в интернет-магазине Либерти
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
 ·  Сландо - работа в Москве: огромная база вакансий и резюме  ·  отличный выбор ванны чугунные с доставкой  ·  недорогие межкомнатные двери в интернет-магазине  · 

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler