Дефосфорилирование можно проводить прямо после рестрикции (не переосаждая). CIP работает в следующих буферах компании New England Biolabs: NEBuffer 2, 3, 4 (и для EcoR I, BamH I, Sal I).
* 0.1u/pmol 5' концов (~1µg 3kb фрагмента); для 3' и тупых концов брать в 10 раз больше. Разводить CIP в 1х буфере перед применением. Если буфер не подходит его можно быстро заменить на спин-колонке (лучше после инактивации рестриктазы).
При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров).
1µg/ml< Coпт(Vector + Insert) <7µg/ml,
Сильное ингибирование, если C>10µg/ml.
Оптимально, если вектор дефосфорилирован, а Insert/Vector <1.
При лигировании лучше не использовать to=+4oC. Лучше лигировать:
* тупые концы: 14oС ON,
* липкие: 14-16oС ON (для библиотек); NT (на столе) 1-2h для рутинного лигирования.
Введение в лигазную смесь 5% PEG приводит к повышению скорости лигирования в 3-6 раз. NB! не надо использовать PEG при лигировании адаптеров (по крайней мере — по тупым концам), в наших руках адаптеры не лигируются, несмотря на десятикратный молярный избыток адаптеров фрагменты образуют огромные конкатемеры.
ATP можно добавить непосредственно к лигазе до 5-10mM.
PEG какой молекулярной массы лучше вводить для повышения скорости лигирования?
Baudelaire/19.07.2005 13:22/
я использовал 6000
Гость/26.08.2005 09:46/
А CIF не инактивируется нагреванием? Или просто потом отфенолить смесь вместо фореза
Гость/05.09.2005 18:32/
CIP не инактивируется, но можно использовать Shrimp Alkaline Phosphotase - которая инактивируется.
гость: Г/19.12.2005 14:56/
Люди, подскажите, а можно лигировать сразу, без дефосфорилирования?
Guest/19.12.2005 18:19/
"Люди, подскажите, а можно лигировать сразу, без дефосфорилирования? " можно
spopov/12.06.2006 18:15/
ludi! a esli est 3 fragmenta vector (Nco-Ecor), i dva fragmenta(NCO-Nhe, Nhe-Ecor1) kak lu4she ligirovat?
Гость/11.07.2006 17:44/
с божьей помощью, ИМХО
Gost'A/17.07.2006 16:50/
Народ, подскажите плеасе, как бы по-ловчее сшить ПЦРом несколько ПЦР-продуктов? Спасибо!
Alder/18.07.2006 18:14/
праймеры дизайните так, чтобы "промежуточные" продукты отжигались друг с другом, и все.. у меня в таких случаях зазве что много побочных фрагментов синтезируется,
curious67/19.07.2006 11:40/
а тщательнее надо 1) дизайнировать участок перекрывания, и делать аккуратнее пересхлоп- и не будет никаких проблем с дополнитю продуктами. Могу рассказать подробнее
curious67/19.07.2006 11:40/
а тщательнее надо 1) дизайнировать участок перекрывания, и делать аккуратнее пересхлоп- и не будет никаких проблем с дополнитю продуктами. Могу рассказать подробнее
curious67/19.07.2006 11:41/
а тщательнее надо 1) дизайнировать участок перекрывания, и делать аккуратнее пересхлоп- и не будет никаких проблем с дополнитю продуктами. Могу рассказать подробнее
Anna P./19.07.2006 12:25/
to curious67
Расскажите, пожалуйста!
curious67/19.07.2006 13:27/
на самом деле, хитрости тут немного. Берете, скажем, для простоты, 2 фрагмента, полученные ПЦР, так, чтобы 3"-конец первого перекрывался с 5"-концом второго пар на 15-17 (темп. отжига 55-60оС). От праймеров и прочего (если матрица-плазмида, то и от исходной матрицы) надо почиститься на форезе. Элюат обеих полос смешиваете эквимолярно, кладете нг эдак 10 каждого в ПЦР смесь, только концевых олигов пока не кладете (концевые олиги- это ПЦР праймеры 5"-концевой от первого фрагмента и 3"-концевой от второго, они теперь у Вас внешние праймеры), скажем, на 50 мкл. Ставите режим достройки: 95оС-15 с, 55(60)оС-3 мин, 72оС-30-60с в зависимости от длины, 5 циклов. Снимаете, добавляете концевые праймеры и ставите нормальный ПЦР циклов на 10-12. Все
curious67/19.07.2006 13:28/
deleted by author
curious67/19.07.2006 13:28/
deleted by author
Guest/19.07.2006 15:01/
to curious67:
Скажите, а в повторении каждого сообщения по три раза есть какой-то скрытый смысл или это у вас случайно получается?
curious67/19.07.2006 16:58/
смысла, а тем более, умысла, нет, просто сетка такая, очень долго обновляется, если не дождаться и еще раз нажать на "отправить", будет такая вот ерунда. Исправил, не волнуйтесь
Anna P./19.07.2006 17:21/
Ну это и так понятно Я думала Вы еще какие-нибудь хитрости знаете
curious67/19.07.2006 17:23/
рад, что Вам все очевидно. Редкий случай- по разговорам с коллегами, они делают все далеко не так, имея в результате циклов эдак вдвое больше, а потом сиквенируют до изумления
Гость/19.07.2006 21:09/
Sorry for English(Its OK reply in Russian) Anybody can write a detailed protocol for short oligos cloning? 1) Annealing: buffer/concentrations(oligos already with 5'p grope 2) for ~50ng of dephosphorilated vector how march I should use annealed duplex? 3) any difference in time of ligation comparing to what ligase protocol say
Gost'A/21.07.2006 21:52/
2 curious67 Спасибо!
Atropos/23.10.2006 00:25/
(Gost'A @ 17.07.2006 17:50)
подскажите плеасе, как бы по-ловчее сшить ПЦРом несколько ПЦР-продуктов?
Есть ещё .
comp3v/23.10.2006 09:27/
(Atropos @ 22.10.2006 23:25)
Есть ещё .
но там, как я понял, придётся вместо двух ПЦР + одного лигирования ставить одну ПЦР + два лигирования, так?
Atropos/23.10.2006 10:24/
Да, вместо третьей ПЦР рестрикция+лигирование. В каких=то ситуациях кому-то может быть удобнее.
curious67/23.10.2006 18:45/
прикольно
curious67/25.10.2006 11:44/
я тут подумал, эта Ear I не полиндром, должна быть довольно частотна, так что далеко не всегда сработает данный метод, тогда как традиционный в 2 ПЦР (ну, или 3, как считать) - всегда
Guest/25.10.2006 16:00/
Конечно, не всегда, но там несколько возможных рестриктаз, мне даже больше BsmAI на вид нравится. Чтобы все попали в область этих двух участков - маловероятно.
curious67/25.10.2006 17:20/
ну да, видимо, все рестриктазы IIs-type сюда попадают. Надо будет запомнить
Atropos/29.10.2006 23:32/
Ещё интересные рекомендации встречал. Силекс пишет: "Для улучшения результатов трансформации, мы рекомендуем инактивировать лигазу прогреванием при 65 oC в течении 10-15 мин. Выход трансформантов существенно улучшается (выход может увеличиться в 100 раз)." А Roche: "Heat inactivation should only be done if the ligation reaction mixture is used in experiments other than transformation assays. Otherwise, a drastic decrease of (> factor 20) transformants is possible."
Интересно, кто же прав?
curious67/30.10.2006 12:59/
ну, Силексу доверия мало. Я думаю, что нагревание не улучшает матрицу, скорее, действительно, трансформация получится хуже. Я бы подумал над добавлением ЭДТА 1 мкл 0.5М, скажем. с дигазную смесь для диссоциации лигазы от ДНК- комплекс ДНК-лигаза весьма устойчив (на р/а форезе такой шмер доверху, если не добавить ЭДТА), может затруднять трансформацию. Или вообще переосадить, как для электротранформации. не помешает. А вот нагревать бы не стал
comp3v/01.11.2006 21:19/
Хм... в инвитроджиновском мануале для T4 они добавляют EDTA при лигировании вставки (как для липких, так и для тупых концов), но нагревают при лигировании адаптеров и лямбда-клонировании. А в протоколе Ферментас - вообще, как я понял, не инактивируют!
klav/01.11.2006 22:42/
Не, инактивируют. 65 С 10 мин, а потом ещё и экстрагируют хлороформ-изоамиловым (это перед электропорацией).
curious67/02.11.2006 13:48/
перед электропорацией я просто переосаждаю- этого достаточно, потерь нет, при экстракции %10 потеряете по любому.
guestA/02.11.2006 17:31/
(curious67 @ 02.11.2006 13:48)
перед электропорацией я просто переосаждаю- этого достаточно, потерь нет, при экстракции %10 потеряете по любому.
Да, экстрагировать -- теряется, увы, да и лениво... А я даже не переосаждаю лигирование, а просто беру мало-мало или развожу водичкой. Нормально трансформируется.
comp3v/02.11.2006 17:39/
А во сколько Вы разводите? Я обычно беру на трансформацию 3-4 мкл из 20 мкл лигазной смеси (не разводя) - наверное, это даже много?
guestA/02.11.2006 23:08/
(comp3v @ 02.11.2006 17:39)
А во сколько Вы разводите? Я обычно беру на трансформацию 3-4 мкл из 20 мкл лигазной смеси (не разводя) - наверное, это даже много?
Мне кажется, 3-4мкл лигазной смеси -- это много для электропорации, потому что вносится много солей, и раствор с клетками будет обладать значительной проводимостью. Я ставлю лигирование в 10мкл, на трансформацию беру 0.5мкл. Можно брать еще меньше: если взять тооонкий носик и в него набрать столько, что глазами еще видно, а меньше взять уже не получается. Это я называю мало-мало. Или развожу 1мкл лигирования в 10 раз и беру 1мкл из разведения. Оставшуюся смесь замораживаю, чтобы если что, можно было повторить. Перед трансформацией обычно инактивирую лигазу нагреванием на 65 град. 15 минут. Впрочем, иногда забываю инактивировать, и пока не заметила разницы в эффективности.
curious67/03.11.2006 14:03/
а я беру по 1 мкл- пробоя не бывает, растет, естественно, больше. А так guestA во всем прав
curious67/03.11.2006 14:06/
и вообще, все зависит от того, что Вы хотите иметь после транформации любым методом, т.е. сколько колоний и для каких целей. Полоса клонируется- думаю, пары десятков колоний хватит, если все сделано грамотно, в этом случае электропорация чересчур. Если у Вас кДНК пул, сложность оценена в 10-20 тыс уникальных транскриптов, то надо иметь 100 тыс колоний, соответственно, и на трасформации стараться
Гость/29.01.2007 06:03/
скажите, пожалуйста, при какой температуре лучше инактивировать BamHI-рестриктазу перед дефосфорилирование?
Гость/29.01.2007 10:14/
какое всё-таки молярное соотношение вектор : клонируемый фрагмент нужно брать. в одних методиках написано(к примеру Weiss B.) "Молярное соотношение вектор : клонируемый фрагмент 1:3", в других - наоборот 3:1, 5:1.
Guest/29.01.2007 10:26/
(Гость @ 29.01.2007 09:14)
какое всё-таки молярное соотношение вектор : клонируемый фрагмент нужно брать. в одних методиках написано(к примеру Weiss B.) "Молярное соотношение вектор : клонируемый фрагмент 1:3", в других - наоборот 3:1, 5:1.
зависит от размера вставки
Гость/29.01.2007 12:05/
если вставка 2 kb, вектор pCMV-Tag2A(4.3 kb)?
Guest/29.01.2007 12:21/
здесь все укладывается в классические условия, потому, как рекомендуют преподобные Сэмбрук и Маниатис, 1:1.
Guest/29.01.2007 12:32/
ага, вот еще формулка от Промеги: (нг вектора х кб вставки/кб вектор) х молярное соотношение = нг вставки это из мануала к ТА киту. Там же сказано, что в общем случае успешны бывают соотношения от 1:3 до 3:1
Гость/29.01.2007 14:41/
Большое спасибо!
Guest/29.01.2007 16:27/
(Guest @ 29.01.2007 11:32)
ага, вот еще формулка от Промеги: (нг вектора х кб вставки/кб вектор) х молярное соотношение = нг вставки это из мануала к ТА киту. Там же сказано, что в общем случае успешны бывают соотношения от 1:3 до 3:1
А молярное соотношение чего к чему?
Guest/29.01.2007 16:37/
вектор/вставка
Guest/29.01.2007 16:38/
тьфу, блин, вставка/вектор
Horse-radish/04.02.2008 14:07/
> Сильное ингибирование, если C>10µg/ml
Это связанно только с низкой концентрацией лигазы или есть еще причины?
Гость/18.04.2008 19:53/
Привет всем! А у меня вообще жуткие проблемы с работой лигаз. Никогда прежде подобного не встречала: после трансформации вообще ни одной колонии. Причем эффективность самой трансформации завидная. Явно что-то сильно влиет на работу фермента, только не могу понять что?
GuestB/07.08.2008 15:20/
Как проверить прошло ли лигирование? Я лигирую кассету, затем лигирую ее в плазмиду. Можно проверить форезом? Или целесообразние ставить сразу второе лигирование, трансформировать и смотреть результат?
guest: ммм /07.08.2008 17:20/
--Явно что-то сильно влиет на работу фермента, только не могу понять что?
Возможно(как один из вариантов) плохие липкие концы, если вы по ним лигируете. Те старый ПЦР или плохие рестриктазы.
25,65 ЕUR/24.03.2009 21:02/
"При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров)."
Использование слишком низких концентраций чего, вектора? Заранее спасибо за ответ.
путьведев/24.03.2009 21:11/
Логин 25,65 евро - неудачный. Надеюсь имя "путьведев" сработает. Вопрос выше.
guest: ммм /24.03.2009 21:18/
Ну что вы сами догодаться не можете?
Это ж очевидно вытекает из закона действия масс.
А второй ник страшен тем, что похож на спамбота.
спамбот/24.03.2009 21:52/
Я после нескольиких неудачных раундов лигирования уже в свою догадливость не верю. Очевидно, дефосфорилированный вектор самолигироваться не может. Конкатомер как я себе представляю образуется по схеме вектор-вставка-вектор-...-вставка-вектор-вставка (если разные сайты рестрикции). Чем больше /С/ вектора тем больше молекул конкурируют за свободый конец вставки. Так же вроде?
guest: ммм /24.03.2009 22:17/
--При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров).
Это написано не для дефосфорилированного вектора.
Дальше что.
Да, лигирование один из самых капризных шагов в клонировании и часто похож на алхимию.
Чего вы хотите. Эксперементируйте думайте и проверяйте все ваши реактивы в контрольных экспериментах. Главное не пытаться быстро и малой кровью получить результат за деньги или из какого-то волшебного протокола.
comp3v/24.03.2009 22:24/
(спамбот @ 24.03.2009 19:52)
Я после нескольиких неудачных раундов лигирования уже в свою догадливость не верю. Очевидно, дефосфорилированный вектор самолигироваться не может. Конкатомер как я себе представляю образуется по схеме вектор-вставка-вектор-...-вставка-вектор-вставка (если разные сайты рестрикции). Чем больше /С/ вектора тем больше молекул конкурируют за свободый конец вставки. Так же вроде?
вы, если хотите совета - лучше напишите сюда конкретно ваши условия реакции и сколько чего берёте - глядишь, и порекомендуют чего как улучшить.
спамбот/24.03.2009 22:41/
2 mmm Спасибо. Ну вобщем я и думаю, вслух. У коллег на с тем же вектором все прекрасно получается. Судя по всему у меня что-то не так...
Блин... А ведь я судя по всему туплю - зачем я дефосфорилирую вектор, резаный по разным сайтам?
Не пытаюсь, денег нет, в волшебные протоколы не верю. Спасибо.
2 comp3v Думаю условия много света не прольют. Вот они: вектор pEGFP-C3, вставка 1кb, XhoI Sal I. Протокол: рестрикция, дефосфорилирование вектора (я выше написал, видимо это необязательно), очистка на форезе, лигирование Fast T4 DNA ligase (Fermentas) 1час, 2 мкл лигазной смеси для трансформации, штамм ХL-1
comp3v/24.03.2009 22:44/
(спамбот @ 24.03.2009 20:41)
2 comp3v Думаю условия много света не прольют. Вот они: вектор pEGFP-C3, вставка 1кb, XhoI Sal I. Протокол: рестрикция, дефосфорилирование вектора (я выше написал, видимо это необязательно), очистка на форезе, лигирование Fast T4 DNA ligase (Fermentas) 1час, 2 мкл лигазной смеси для трансформации, штамм ХL-1
Это ещё не протокол. Напишите, сколько чего берёте на лигирование - сколько вектора, сколько вставки, сколько лигазы.
Guest/25.03.2009 07:17/
поставьте overnight или хотя бы с утреца на день. не верю я в эти все fast ligase, один вред от попыток сэкономить время таким образом.
Guest/25.03.2009 07:22/
да, а главное - лучше не пытайтесь резать пцр-продукт, а залигируйте его в промежуточный вектор (по тупым концам или ТА), выделите плазмиду и вырежьте из неё свой фрагмент, а потом уже лигируйте. Так всё получится почти наверняка.
guest: 1 /25.03.2009 12:38/
Спасибо Guest. C этой фаст-лигазой, вообще что-то странное, имхо. После неудачной трансформации, разогнал лигазную смесь на форезе - намного ниже 10 000 жирная полоса, и слаааабый шмер по всему интервалу вплоть до 1000 где-то. Я не очень понимаю как это интерпретировать.
Моя коллега так и делает - лигирует в pJet по тупым концам, потом режет и потом лигирует в pGFP Я решил время сэкономить. Ну и по моим представлениям все должно получаться и с пцр-продуктом.
e.coli/25.03.2009 16:17/
Ligase binds DNA and will retard and spread gel bands when present along with the DNA. If you want to visualize ligation reaction results, you should heat kill the ligase (20 minutes at 65C) before running the gel. This works poorly for ligation reactions containing PEG such as virtually all "quick ligation" buffers. For cohesive end ligations, regular ligase works as well or better than those quick ligation buffers.
Отсюда:
По крайней мере частичное объяснение.
Guest/25.03.2009 18:10/
(guest: 1 @ 25.03.2009 11:38)
Спасибо Guest. C этой фаст-лигазой, вообще что-то странное, имхо. После неудачной трансформации, разогнал лигазную смесь на форезе - намного ниже 10 000 жирная полоса, и слаааабый шмер по всему интервалу вплоть до 1000 где-то. Я не очень понимаю как это интерпретировать.
Моя коллега так и делает - лигирует в pJet по тупым концам, потом режет и потом лигирует в pGFP Я решил время сэкономить. Ну и по моим представлениям все должно получаться и с пцр-продуктом.
ну это оно должно. Но часто не работает. Насчёт лигаз - я пользуюсь промеговской лигазой в fast ligation буфере (2х который), но ставлю не на два часа, а на ночь или часов на 6. Всё лигируется.
guest: 1 /26.03.2009 13:12/
Поставил на ночь, в pJET сегодня попробую трансформировать. Завтра узнаю что и как.
Guest/28.03.2009 09:20/
расскажите потом! а то все пишут, когда у них что-то не получается, а об удачных экспериментах молчат. А это зря.
Miss Marple/23.09.2009 14:30/
Добрый день! После лигирования получили 1-2 колонии на чашку - что есть мало. Пожалуйста, подскажите, что не так. (Пропись использовали и раньше с другой линейной ДНК, получали в среднем 20 колоний на чашку.) ПЦР-или плазмиду 5,5кб, убирая её "кусок" ПЦРом. На 5прайм конце праймеров - половинки добавочного сайта рестрикции. Судя по гелю, выход продукта ПЦР где-то 1 микрограмм. После очистки - 40нг/мкл.
Phosphorilation: 30mkl DNA (40ng/mkl, purified from gel PCR product of full lenth plasmid) 1,5mkl 50mM ATP 1mkl PNK Fermentas 3,6mkl PNK buffer A 90'37C 10'70C
Ligation: 1mkl T4 DNA Ligase (NEB) 5mkl T4 ligase buffer 5mkl PEG 4000 50% 16mkl linear phosphorilated DNA 23mkl H2O 1h room temperature
Transformation DH5alfa Трансформируется вся лигазная смесь полностью. Потом все полностью расторается по чашке. Есть подозрение, что фосфатаза не сработала. Как проверить, какие контроли поставить?
guest: ммм /24.09.2009 08:56/
Есть подозрение, что фосфатаза не сработала. Есть подозрения что не очень эффективная трансформация или лигирование.
Miss Marple/24.09.2009 12:52/
(guest: ммм @ 24.09.2009 07:56)
Есть подозрения что не очень эффективная трансформация или лигирование.
Трнасформация стандартная, как всегда (30 минут на льду без теплового шока), клетки высококомпетентные - 50нг контрольной плазмиды дают 30-50 колоний на чашку (по-другому компетентность не проверялась и не пассчитывалась). Пробовала вчера ставить лигирование по-другому: 12 мкл Вода 5мкл фрагмент ДНК 35нг/мкл (фосфорилировала более свежей фосфокиназой) 2мкл Буфер 1мкл фермент (НЕБ)
В 20мкл, 2 часа на столе - как указано в брошюре для фермента (также без добавления ПЕГ). Итог - ноль колоний.
guest: ммм /24.09.2009 13:03/
-рнасформация стандартная, как всегда (30 минут на льду без теплового шока), клетки высококомпетентные - 50нг контрольной плазмиды дают 30-50 колоний на чашку (по-другому компетентность не проверялась и не пассчитывалась).
Вы этот +контроль, вчера ставили?
Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь.
Miss Marple/24.09.2009 15:10/
(guest: ммм @ 24.09.2009 12:03)
Вы этот +контроль, вчера ставили?
Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь.
50 нг плазмиды как положительный контроль - дали (не считала), но на глаз - где-то под сотню колоний. Контроли без лигирования тоже ставлю: 100нг линейной фосфорилированной ДНКи (ноль колоний, в том числе когда при лигировании было 1-2 колонии на чашку). Что еще не учла? какие еще контроли?
Miss Marple/30.09.2009 14:56/
(guest: ммм @ 24.09.2009 12:03)
Вы этот +контроль, вчера ставили?
Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь.
Просто в качестве апдейта: Коснструкт "сработал" из одного клона и был пущен на дальнейшее клонирование вставки по двум сайтам рестрикции. На рестрикцию было взято 3мкг плазмиды, но на этот раз фрагмент вырезался под 366нм УФ, а фотографировались "дырки" на геле. Продукт элюировлся в 30мкл буфера и 10мкл было взято на лигирование. Итог - несколько сотен колоний на чашку. Практика фотографирования "дырок" взята на заметку....
Guest/12.12.2009 00:26/
Как лучше чистить лигазную смесь для электропорации? Или можно вооще не чистить? Переосаждать что-то не хочется - слишком маленькие количества, потеряется всё. Можно ли китами для очистки пцр-продукта? плазмиды 3-15 кб.
RJ Dio/13.12.2009 22:30/
китами тоже потеряете. Возьмите 1 мкл из лигазной реакции per se на 50 мкл клеток, 5мсек, конечно, не будет, но 4,0-4,4 получится. Сойдет
Guest/14.12.2009 18:12/
говорят, так электропоратор сломать можно, если не чистить
RJ Dio/14.12.2009 18:55/
полный бред, не надо путать с плохим бензином в бензобаке
nifloW/09.03.2010 12:02/
Подскажите, пожалуйста, в чем м.б. причина отсутствия колоний (осенью получала 20 на чашку)? ПЦР продукт 955 п.о. выделен электрофорезом, почищен нашим набором "БиоСилика" Лигирую в pGEM-Tvectot или Т-easy ON во льду в соотношении 1:1,5
Электропорация 2мкл лигазной смеси в 60 мкл комп. клеток (10^8 на pUC19)DH5alpha импульс 5мс (1.8кВ, 1мм кюветы) хот.шок 47С в LB бульон (МgCl2,Glc) инкубация на 37С 1 час Рассев 200мкл на чашку LB агар 2% (Amp200, X-Gal, IPTG) 37С ON
RJ Dio/09.03.2010 12:26/
а зачем и порация, и хотшок? Это новации в клонировании такие? Либо одно (42, а не 47-на секундочку!), либо другое. Если не растет, проверьте лигазу
protein/09.03.2010 15:56/
лигаза чья? если ферментас, то это много очень, там хватает 0.4 мкл на 20 мкл лигазной смеси. и послушайте Дио, делайте хеат шок 42, 30-60 сек.
RJ Dio/09.03.2010 17:01/
да, похоже на проблему с лигазой. чтоб вообще ничего не росло- надо постараться
protein/09.03.2010 17:11/
(nifloW @ 09.03.2010 14:02)
Лигирую в пГЕМ-Твецтот или Т-еасы ОН во льду в соотношении 1:1,5
и соотношение подправьте, сделайте 1:3-5
RJ Dio/09.03.2010 19:43/
да не важно, хоть 1:10, влияет только на кол-во рекомбинантов и имеет значение для клонирования библиотек. с фрагментом не будет проблем.
nifloW/10.03.2010 08:23/
Спасибо за советы. Скажите, а как лигазу проверить? Лигаза Promega из набора вместе с вектором и буфером. Методику ставила не я, поэтому для чего и электропорация и хотшок не знаю. Проблема в том что раньше все работало. Дело именно в лигировании, т.к. контроль с pUC19 растет прекрасно. А с лигазной смесью нет даже синих колоний. Вчера поставила на +15 лигирование 2.5 часа, запорировала. В итоге из 4х лиг. смесей, только на одной чашке одна колония.
RJ Dio/10.03.2010 13:00/
возьмите любую др. лигазу, сравните
nifloW/11.03.2010 08:28/
Дело в том, что я делала с лигазой для pGEM-T-easy и с лигазой для pGEM-T vector-ров. Можно ли считать это контролем с др. лигазой?
RJ Dio/11.03.2010 12:13/
лигаза и в Африке лигаза. Думаете, Промега делает 2 (3, 4 и тп) разные лигазы для разных китов? так не бывает
nifloW/12.03.2010 07:21/
Логично... не подумала. Проверила с другой лигазой. Поставила ПЦР+форез
Итог - дорожки пусты, только маркер. Ставила с новой лигазой, не из наборов для вектора, как со старым буфером так и с новым, с ATP и без (того 4 дорожки не считая контроля и маркера). Ранее так же гоняла два набора векторов с их лигазами (+ доп контроли без лигаз) - дорожки пусты.
RJ Dio/12.03.2010 11:37/
во-первых, что вы хотели проверить ПЦР? Слигировалось или нет? ОК, а сколько циклов поставили. надо хорошенько считать циклы, исходя из кол-ва вектора в лигировании в приближении, что не более 1% материи представляет собой аплифицибельный ампликон, то есть еще уиклов 7 добавьте. Да и возьмите в голову, что комбинация праймеров T7 -SP6 очень плоха, SP6 вообще крайне мягкий и плохой в ПЦР праймер. Возьмите вместо него сиквенс-специфический реверс
nifloW/14.03.2010 08:53/
Да, хотела проверить идет ли лигирование. Ставила 35 циклов. Вектора 0.6мкл (50нг/мкл) в 10 мкл лиг смеси - из нее брала 2мкл для ПЦР. Специфический реверс -для той вставки которыю лигирую, подобранный мной? Спасибо за советы!
RJ Dio/14.03.2010 18:51/
можно и так, но я никогда так не делал- а зачем, либо растет после трансформации, либо нет, а от того, что ПЦР имеется, клонов не станет больше
nifloW/15.03.2010 07:34/
Я просто уже не знаю, что же не так и почему не растут клоны( Однако и ПЦР ничего не прояснила.
RJ Dio/15.03.2010 12:09/
во-во. и не прояснит. Надо копать дальше, вопросы будем обсуждать.
nifloW/16.03.2010 07:31/
Все оказалось просто... и глупо - неправильно подсчитана компетентность клеток. Не 10в8, а 10в6. Так что чистые чашки вполне закономерны(((
velekap/16.05.2014 10:22/
Подскажите, кто-нибудь ставил лигирование Т4 лигазой на выходные при +4 или RT?
Epsilon/16.05.2014 14:04/
Да, регулярно ставлю и на 16 часов, и на 24, и на пару дней. Обычно от 10 мкл лигазной реакции беру на трансформацию 3 мкл и если результат трансформации не устраивает, то её можно повторить на следующий день, а лигазная смесь всё это время стоит на +4 и с ней всё в порядке. Использую T4 ligase от Promega.
R.J.Dio/19.05.2014 18:09/
ставьте на 5 мин, что за проблема, ПЭг- и вперед, только следите за качеством реактивов
velekap/28.05.2014 17:06/
С чем может быть связаны проблемы с клонированием? вставка/вектор~5, рестрикты проверены на форезе после очистки китом, на x-gal вырастают белые и синие колонии, но белые на ПЦР всё равно не дают вставки. Специфичность праймеров проверена на лигир. смеси и хромосоме MG. Можно уже утверждать, что проблема не в реагентах, а в технике выполнения. Но всё-таки, если кто-то сталкивался неописанными проблемами, поделитесь своим опытом выхода из ситуации?
R.J.Dio/29.05.2014 10:02/
размер вставки?
Esya/29.05.2014 15:22/
как правило, это связано с тем, что слишком мало нуклеотидов добавлено в праймерах по концам
Epsilon/29.05.2014 17:58/
Тут два варианта: - либо Ваша встройка не лигируется в Ваш вектор (несовместимые концы из-за непрошедшей рестрикции, как Вам говорили, либо проблемы с фосфорилированием 5' концов...), - либо встройка выкидывается из вектора после лигирования при репликации плазмиды. Разновидность этого варианта: негативная селекция против плазмид, содержащих встройку.
Если Вы делали ПЦР с лигазной смеси и видели продукт, соответствующий лигированной плазмиде, то вероятнее второе объяснение. Опять же, белые колонии могут означать, что рамка гена LacZ всё же сдвинута остатками неудалённой встройки...
Нам в подобных случаях помогало изменение ориентации встройки на противоположную, либо использование специального вектора без селективного гена и с терминаторами транскрипции по краям от полилинкера.
Вы не секвенировали встройки в плазмидах из белых колоний?
velekap/29.05.2014 18:38/
(R.J.Dio @ 29.05.2014 11:02)
размер вставки?
размер гена ~1400 bp
velekap/29.05.2014 18:46/
(Epsilon @ 29.05.2014 18:58)
Тут два варианта: - либо Ваша встройка не лигируется в Ваш вектор (несовместимые концы из-за непрошедшей рестрикции, как Вам говорили, либо проблемы с фосфорилированием 5' концов...), - либо встройка выкидывается из вектора после лигирования при репликации плазмиды. Разновидность этого варианта: негативная селекция против плазмид, содержащих встройку.
Если Вы делали ПЦР с лигазной смеси и видели продукт, соответствующий лигированной плазмиде, то вероятнее второе объяснение. Опять же, белые колонии могут означать, что рамка гена LacZ всё же сдвинута остатками неудалённой встройки...
Нам в подобных случаях помогало изменение ориентации встройки на противоположную, либо использование специального вектора без селективного гена и с терминаторами транскрипции по краям от полилинкера.
Вы не секвенировали встройки в плазмидах из белых колоний?
нет, не секвенировали. Насчёт изменения ориентации- делал лигазные смеси по sticky и blunt - на обоих ПЦР показал наличие встройки (правда, только перекрёстными праймерами, фланкирующие показывают отсутствие, хотя это может говорить, только о том, что плазмиды со встройкой просто очень мало почему-то). А почему при репликации может выкидываться встройка?
Epsilon/29.05.2014 19:35/
Интересно... То есть отсутствие встройки в плазмидах из белых колоний Вы смотрели по длине рестрикционных фрагментов?
А ПЦР показывает лигирование по обоим сайтам? Вообще, вариантов, при которых у Вас не прошло лигирование, гораздо больше, чем вариантов полного и бесследного удаления встройки в результате её нестабильности. Если можно, опишите подробнее последовательность Ваших действий (ПЦР, рестрикиция, CIAP дефосфорилирование, T4 PNK фосфорилирование, лигирование...). Что конкретно Вы делали?
---
К сожалению, причины нестабильности встроек мне известны плохо. Просто я много раз сталкивался с тем, что при клонировании по тупым, либо А/Т концам наблюдается существенная асимметрия направления встройки в клонах, что говорит о селекции против плазмид с одной из ориентаций. Также сталкивался с отсутствием клонов при попытке клонировать встройку в заданной ориентации по разным липким концам.
Вероятно, некоторый вклад в возможную нестабильность вносит транскрипция и трансляция встройки, которая имеет место в векторах с репортёрным геном типа серии pUC.
R.J.Dio/30.05.2014 09:53/
ваше описание проблемы, действительно, страдает огорчительной неполнотой данных. Опишите все по порядку: вектор, по каким сайтам делался, вставка, какие сайты. если резался ПЦР, то как Вы контролировали полноту рестрикции фрагмента, сколько букв на концах праймеров, если все же был ПЦР. были ли выставлены контроли- нерезанная плазмида, резанная по одной из рестриктаз, все это желательно предоставить в наглядном виде, со слов не принимается. иначе делу не поможешь. А мистику типа рекомбинации оставьте для полоскания мозха студентам, они учебники читают, там такое есть, а в практике редко. Да, и еще- анализ рекомбинантов следует делать ПЦр с колоний стандартными праймерами М13, коли у вас есть бело-голубая селекция, и не придумывать велосипед. ПЦРить лигазную смесь не только бессмысленно, но и вредно, результаты ни о чем не говорят, просто руки занять. ВЫ же по результатам такого ПЦР в любом случае не откажитесь ставить трансформацию с последующим анализом, тогда зачем время и реактивы тратить- чтоб шеф видел, что вы не в Фэйсбуке сидите?
velekap/30.05.2014 10:19/
Хорошо. описываю подробно эксперимент. Вектор pMW118, разрезался EcoRI/BamHI (ночьб 2XTango), форез соответствует рестрикту (но сначала делал разрезы по очереди и смотрел на форезе, рестрикция по каждой из этих рестриктаз идёт). Вставка -ПЦРный ген со встроенными по краям сайтами EcoRI и BamHI, по 4 nt от места разреза. проверка вставки была и праймерами M13 (полосы соответствуют контролю, но у образцов слегка прыгают), и перекрестными (М13+праймеры на сам ген), которые на лигазной смеси и показали наличие вставки (лигазную смесь не в первый раз пцрил, но если не видел намёка на вставку, не трансформировал). Дефосфорилирование тоже не помогло - отбирал плазмиды без вставки, но белые на x-gal. Раз не получалось по липким, попробовал по тупым, плазмиду порезал по SmaI и с PEG залигировал с геном. И опять по M13 полосы на уровне контроля, а с перекрестными намёк на вставку. Опять же отбирал на x-gal белые колонии.
R.J.Dio/30.05.2014 11:54/
похоже на то, что в одном из праймеров реально нет сайта рестриктазы (какой-то). Это раз. Далее, надо проверить лигазу- возможно, то что вырастает, это всякого рода недорез вектора (только не надо говорить, что тогда колонии будут голубыми- ночь с ферментасом - не каждый конец переживет, не пользуйтесь ни Ф., ни ночными развлечениями, нормальная рестриктаза NEB делает все за макс. 1,5 часа). Ну и опять же, рестриктазы поменяйте и не более 2-ух часов. Это первой, что приходит на ум
ship/30.05.2014 17:29/
Eco-BamHi режу в Бамовском буфере (кстати в нем режут очень многие ферментасовские рестриктазы), достаточно 2 ч, на ночь не стоит. и я что-то не понял, вы вставку только по ПЦР смотрите? по Eco-Bam ничего не вырезается? и опять таки описание не полное. как вектор чистили после рестрикции? как чистили вставку?
R.J.Dio/30.05.2014 18:48/
вставка у него вроде ПЦРом генерится, сайты на концах, как смотреть рестрикцию, длина неизменна. Про почистку вектора я даже не спросил, вроде гель сам собой разумеется...Хотя...Блин, все бывает, действительно. И вставка тоже, если ПЦР с плазмиды, оно и растет, если без геля и антибиотик не меняется. Вариант. Но это ж ни в ..., ни в Красную Армию. Надеюсь, что все не так
velekap/02.06.2014 14:41/
(ship @ 30.05.2014 18:29)
Eco-BamHi режу в Бамовском буфере (кстати в нем режут очень многие ферментасовские рестриктазы), достаточно 2 ч, на ночь не стоит. и я что-то не понял, вы вставку только по ПЦР смотрите? по Eco-Bam ничего не вырезается? и опять таки описание не полное. как вектор чистили после рестрикции? как чистили вставку?
Вставку смотрел только по пцр. Поскольку плазмида малокопийная, чтобы увидеть разваливается ли она на две части, это ж надо нарастить много культуры, потом выделить плазмиду - процесс долгий, но я к нему уже подхожу) Для начала вобью её в штамм-ауксотроф по своему гену и там посмотрю по пцр. Возможно, правда, своей долгой рестрикцией я как-то подпортил концы вставки или вектора, хотя эти рестриктазы не значатся звёздными в 2ХTango. Вектор и вставку после рестрикций чистил китом ферментосовским с селикагелем вроде.
R.J.Dio/02.06.2014 15:44/
то есть без геля? Ну и все, вот вам ответы на все вопросы. Это у вас растет недорез вектора (он есть всегда, не , не так, ВСЕГДА! вне зависимости, видите ли вы его глазками или нет. Только гель! Потому как 100 ретрикций не бывает, есть формы плазмиды, которые не режутся и режутся намного медленнее, конкатамеры всякие, подплавленные одноцепочечные участки, бог ведает что. вам 0,1 % недреза хватит за глаза, прикиньте сами- скажем, 0,1%- это 0,1 нг минимум. С 1 мкг растет 10 в 7. Ну ладно, 10 в 6. Сколько будет фона? Правильно, 10 в 3. Тыща штук. И никогда ничего не заклонируете. Мало плазмиды для вырезания- мужайтесь, копите материю и...режьте из геля
ship/02.06.2014 16:13/
ну вот, я же говорил)) ну нарастите 1л среды и выделите оттуда плазмиду, классическим протоколом с фенолом, будет максимальный выход.
Esya/02.06.2014 17:06/
Мальчеги, пардон май френч, вы круче я знаю, а на фига гель для вектора? чем он поможет? Вставку надо после писиара чистить, ибо там мелочь пузатая может лигироваться...
берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз.
Для маленьких добавлю, все хорошо перемешивать и перед инкубациями откручивать.
R.J.Dio/02.06.2014 18:12/
ага, еще научи как руки мыть после туалета, умник
ship/02.06.2014 21:44/
(Esya @ 02.06.2014 15:06)
берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз.
спасибо, посмеялся
Esya/02.06.2014 21:52/
в том то и фишка, кому процесс, а кому результат я и обезьяну могу клонировать научить, а вы одному студиозу мозги неделю парите
ship/02.06.2014 22:02/
ну вам в голову не приходит, что при приготовлении вектора из него может вырезаться фрагмент??? и что вы на колонке очистите в этом случае?? плюс недорез, который есть всегда как, сказано выше. то что вы советуете - это моветон, то как не надо делать.
Esya/02.06.2014 22:16/
а вам в голову не приходит, что вставки дается избыток и она, как правило, длиннее, а, значит, вшивается значительно лучше, и что короткие куски с колонкой связываются намного хуже, а меньше 40, вообще, не связываются ?
знаю я таких пуристов, им все моветон, на банальное клонирование им нужно неделя рабочего времени
мне, когда я клонирую, уже ничего в голову не приходит за ненадобностью, в 1001 раз об этом не думают - последний этап думания, когда олиги делаю
Esya/02.06.2014 22:31/
а, вот, недореза, кстати, быть не должно
ship/02.06.2014 22:58/
(Esya @ 02.06.2014 20:16)
а вам в голову не приходит, что вставки дается избыток и она, как правило, длиннее, а, значит, вшивается значительно лучше
вставка длинее чего??? мне не приходит в голову. у меня есть опыт, который показывает, что все далеко не так как в книжках и мануалах.
у меня ощущение, что вы плазмиды вообще в руках не держали, если уверены в том, что недореза не бывает.
и да, неделя уйдет у вас, когда будете разгр*** все то дерьмо, которое вырастет при вашем "способе" клонирования.
Esya/02.06.2014 23:07/
все это было бы смешно, если бы такие учителя тут не учили... ей богу, мои тапочки уже икают
velekap/03.06.2014 11:17/
(R.J.Dio @ 02.06.2014 16:44)
то есть без геля? Ну и все, вот вам ответы на все вопросы. Это у вас растет недорез вектора (он есть всегда, не , не так, ВСЕГДА! вне зависимости, видите ли вы его глазками или нет. Только гель! Потому как 100 ретрикций не бывает, есть формы плазмиды, которые не режутся и режутся намного медленнее, конкатамеры всякие, подплавленные одноцепочечные участки, бог ведает что. вам 0,1 % недреза хватит за глаза, прикиньте сами- скажем, 0,1%- это 0,1 нг минимум. С 1 мкг растет 10 в 7. Ну ладно, 10 в 6. Сколько будет фона? Правильно, 10 в 3. Тыща штук. И никогда ничего не заклонируете. Мало плазмиды для вырезания- мужайтесь, копите материю и...режьте из геля
Я уже писал, что отбираю клоны на X-gal. Действительно много голубых ,но есть и белые, в которых и моя проблема)
velekap/03.06.2014 11:19/
(Esya @ 02.06.2014 18:06)
Мальчеги, пардон май френч, вы круче я знаю, а на фига гель для вектора? чем он поможет? Вставку надо после писиара чистить, ибо там мелочь пузатая может лигироваться... берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз.
Для маленьких добавлю, все хорошо перемешивать и перед инкубациями откручивать.
Всё написанное вами было уже обговорено раннее. Всё делалось так, как и у вас - поэтому у меня и возник вопрос, какие могут быть проблемы в такой простой технике. Ничего нового не написали.
R.J.Dio/03.06.2014 11:19/
спор бессмыслен. у чела не выходит, а вы по сути предлагаете ему ничего не менять, делать как делал. Тогда к чему советы. Недорез есть всегда, это аксиома, просто у вас, далекий американский друг, несколько иные отправные условия- если плазмида чистится на ките, плазмида многокопийная (соотв, и примесей мало при выделении), если берутся суперсвежие ферменты не по единицам, а по микролитрам), то в принципе, можно себе позволить халяву. Подчеркну еще раз- то, что вы советуете, ни коим образом не может быть руководсвом к действию в общем случае. Пример простой- никогда в автошколе вам не скажут- садитесь так, чтоб можно было рулить коленом, а руки свободные держите, одна- для сигареты, а другая- для сотового, всегда почему-то все начинают на "без десяти два"
R.J.Dio/03.06.2014 11:24/
если у студиозуса не получается, а новой инфо якобы он не снял, то вариантов тут много можно предложить, а именно : а) забить на все и всех козлов с советам и продолжать в гордыне б) просто забить и не продолжать в) продумать весь ход работы без гонора и найти ошибку в свете всего вышесказанного ибо она-таки есть, иначе бы все получилось г) окропить стол святой водой и повторить клонирование стати, не уточнялось, фрагмент получен ПЦРом с чего- если с плазмиды с той же устойчивостью, что и целевой вектор, то еще один пойнт- фрагмент также надо чистить на геле (не буду объяснять почему, должно быть понятно)
Alex2006/03.06.2014 14:02/
Лучше всё резать из геля.
velekap, а сколько белых колоний Вы проверили? может просто мало?
если есть праймеры в векторе и вставке, проверьте колоний 40 через "colony pcr" - и наткнетесь на свою вставку. Быстро и эффективно.
Esya/03.06.2014 15:21/
даже с нашими суперсвежими ферментами (вчера пользовалась 05.2007, есть и 2002) на концах праймера у меня 9 экстра нуклеотидов
поэтому, у меня все всегда режется, и у тех, кого я научила тоже, в том числе и в россии (белок из последней российской статьи был проклонирован за 2 дня довольно кривыми руками с использованием мерзкой NdeI)
- всегда и шьется
- и да, экономить это старье ине не приходится, не знаю, когда само кончится, добавляю по микролитрам
повторюсь, проблема не с недорезом вектора, а с недорезом вставки, а недорез вставки из-за - см. выше
R.J.Dio/03.06.2014 15:34/
самоуверенность мадам- от тлетворного влияния западного феминизма, тут клиника, тут все понятно. Ща не об том. 4 буквы хватает всегда, и Nde я нежно люблю, хоть и ругают его за 2 буквы, которые якобы лигируются хуже, чем тупо, что есть бред, конечно. Изя пусть отдохнет и не полощет мозх молодежи А фраза - проклонировано за 2 дня- ну, во-первых, мы не тараканьих бегах, где 2, там и три, тут точно не принципиально, и потом, 2 дня - это без сиквенса, а без сиквенса клонирование не считается. Так можно посчитать, что вовсе за 2 часа все сделано- типа, порезал- значит, заклонировал, Глупота. Короче, чято там с гелем? А ну так вот- резать надо, а Изя отдохнет
velekap/03.06.2014 15:42/
(Alex2006 @ 03.06.2014 15:02)
Лучше всё резать из геля.
velekap, а сколько белых колоний Вы проверили? может просто мало?
если есть праймеры в векторе и вставке, проверьте колоний 40 через "colony pcr" - и наткнетесь на свою вставку. Быстро и эффективно.
Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те.
velekap/03.06.2014 15:48/
(R.J.Dio @ 03.06.2014 12:24)
если у студиозуса не получается, а новой инфо якобы он не снял, то вариантов тут много можно предложить, а именно : а) забить на все и всех козлов с советам и продолжать в гордыне б) просто забить и не продолжать в) продумать весь ход работы без гонора и найти ошибку в свете всего вышесказанного ибо она-таки есть, иначе бы все получилось г) окропить стол святой водой и повторить клонирование стати, не уточнялось, фрагмент получен ПЦРом с чего- если с плазмиды с той же устойчивостью, что и целевой вектор, то еще один пойнт- фрагмент также надо чистить на геле (не буду объяснять почему, должно быть понятно)
ну да, мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск, а потом с новыми силами попытаться опять клонировать) В общем, перезаказал праймеры на вставку, делаю рестрикцию максимум 4 часа, а не ночь, рестрикты чищу не китом. а переосаждаю (после кита почему-то бывали большие потери), концентрации смотрю по форезу и NanoDrop. К концу недели поделюсь результатами. Да, и не студент я)Просто в молбиоле всего чуть больше года и клонирование никогда не делал.
Esya/03.06.2014 16:12/
R.J.Dio - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности
"после кита почему-то бывали большие потери" - спирт в промывочном буфере испарился\выпили
" мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск" представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице
R.J.Dio/03.06.2014 16:24/
R.J.Dio - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности
я? Я не хочу. ни доказывать, что 2х2=4, ничего. У меня-то проблем с клонированием и скоростью ея нету, а имеющий уши да услышит. Воспользуется чел советами- нет, его дело, инфу получил, пусть думает А вы как-то ловко перевели разговор на себя, у вас нету пробем, и еще там чего-то нету (или есть?) , причем тут вы, человек пришел со своим вопросом, а вы все про себя и про себя. точно- америка портит женщин
R.J.Dio/03.06.2014 16:26/
(velekap @ 03.06.2014 16:48)
ну да, мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск, а потом с новыми силами попытаться опять клонировать) В общем, перезаказал праймеры на вставку, делаю рестрикцию максимум 4 часа, а не ночь, рестрикты чищу не китом. а переосаждаю (после кита почему-то бывали большие потери), концентрации смотрю по форезу и NanoDrop. К концу недели поделюсь результатами. Да, и не студент я)Просто в молбиоле всего чуть больше года и клонирование никогда не делал.
ну не студент, ок, но начинающий клонировальщик. Это сути не меняет. Попробуйте так и сяк, где получится, там и правильно.
R.J.Dio/03.06.2014 16:30/
(velekap @ 03.06.2014 16:42)
Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те.
как это М13 отжигаются на хромосоме? Это у вас фоны идут с клеток, грязь, реально пустышка и ПЦР нет. Хотя странно, а почему ж тогда нету короткого ПЦР (фрагмент между двумя М13, полилинкер там и прочая). Что-то у вас в системе напрочь сбоит
velekap/03.06.2014 16:56/
(R.J.Dio @ 03.06.2014 17:30)
как это М13 отжигаются на хромосоме? Это у вас фоны идут с клеток, грязь, реально пустышка и ПЦР нет. Хотя странно, а почему ж тогда нету короткого ПЦР (фрагмент между двумя М13, полилинкер там и прочая). Что-то у вас в системе напрочь сбоит
Чисто с М13 я вижу минимальный фрагмент, вот М13 с праймерами на ген дают неспецифику в пцр с клеток.
velekap/03.06.2014 16:58/
(Esya @ 03.06.2014 17:12)
R.J.Dio - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности "после кита почему-то бывали большие потери" - спирт в промывочном буфере испарился\выпили
" мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск" представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице
ну с юмором у американцев всё понятно) Тем более, что кроме клонирования достаточно работы, а неудача с ним просто стопорить интересный эксперимент.
R.J.Dio/03.06.2014 17:11/
аминь
ship/03.06.2014 17:26/
я б так сделал: может и на пару дней дольше, но результат гарантирован. вам же не 100 плазмид делать.
1. Берете кит для клонирования тупых продуктов ПЦР (выже наверняка ПЦРите пруфридинг полимеразой?). 2. Клонируете туда свой ПЦР ппродукт. 3. Режете по тем сайтам, что у вас в праймерах, убеждаетесь, что они на месте и вырезается нужная вставка. (не пойму тока почему вам нравится скринировать на вставку ПЦРом, а не рестрикцией) 4. Вырезаете вставку из вектора, чистите из геля. 5. Режете целевой вектор, чистите его из геля. 6. Ставите лигирование и скорее всего через пару дней прыгаете от радости.
R.J.Dio/03.06.2014 18:23/
да хоть ТА-вектор, ничего, что пруф-ридинг полимераза, буквы все равно висят (25% по литературе)- так что можно не париться и клонировать куда придется. А так- да, только я б сначала отсеквенил, где ПЦР- там сиквенс, правило хорошего тона, а потом- как написано, перекинуть вставку
ship/03.06.2014 19:06/
(R.J.Dio @ 03.06.2014 16:23)
А так- да, только я б сначала отсеквенил, где ПЦР- там сиквенс, правило хорошего тона, а потом- как написано, перекинуть вставку
ну я и имел это ввиду, тока сначала порезать просто, чтобы понять, что сайты на месте, и вставка скорее всего, то что нужно.
Alex2006/04.06.2014 19:18/
(velekap @ 03.06.2014 16:42)
Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те.
Чисто с М13 я вижу минимальный фрагмент, вот М13 с праймерами на ген дают неспецифику в пцр с клеток.
Почему тогда не провести скрининг клонов м13 праймерами? 2,4 даже 8 - это мало. Если количество белых колоний позволяет - проверьте 20-30 м13 праймерами. Только время отжига выставьте на "фрагмент со вставкой", а не на минимальный.
R.J.Dio/04.06.2014 19:19/
да тут много странностей, и эта- минорная
Alex2006/04.06.2014 19:29/
у него белых колоний много, как я понял. Прежде чем траблшутить весь протокол, логично проверить разумное число колоний и удостовериться, что нужного клона на плашке нет.
есть ощущение, что перескочив щас на субклонирование в левые вектора и на левые пятиминутные протоколы, автор накосячит еще больше
MolBiol.ru >
Методы >
Клонирование > Лигирование
Zbio-wiki
Дополнить
Я думала Вы еще какие-нибудь хитрости знаете 
Нормально трансформируется. 
представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице