TOPO Cloning — система для клонирование от Invitrogen, использующая вместо лигазы фермент Topoisomerase I из Vaccinia virus. Изготовители обещают очень высокую эффективность клонирования (95% для pCR4-TOPO), и это очень похоже на правду. В наших руках эта система очень эффективно работала для клонирования конкретных ПЦР-фрагментов, однако, почему-то давала не слишком большое количество клонов при изготовлении библиотек (лигазная система дала на порядки больше из той же смеси).
Общая идея микроклонирования — получить не десятки тысяч клонов, а приблизительно сотню и за счёт этого сэкономить на реактивах и компетентных клетках. Мы даже пробовали брать по 0.08µl ПЦР смеси (и, соответственно, меньшее количество остальных реагентов, тоже все получалось нормально. Никаких особых пипеток при этом не требуется — мы пользовались обычными 2µl пипетками и стандартными типчиками для них.
По пунктам
п. 4.
Прежде чем проводить "большое клонирование" имеет смысл поставить раститровку на нескольких ПЦР-продуктах и выяснить, какое оптимальное количество ПЦР-смеси следует брать в реакцию. Указанное в протоколе количество было оптимальным для нашей реакции.
п. 8 & 12.
Мы раскапываем на в крышки одним и тем же типчиком, а потом стряхиваем капельки в пробирки на микроцентрифужке.
п. 14.
Прогрев на 40oC можно поставить в предварительно разогретом ПЦР-приборе.
п. 16.
Одна капля SOC — ~30µl.
п. 18.
Удобно использовать VentedQTray with Divider /Genetix X6029/ — это плашка размером 242х240х20mm в которую вставляется решётка с 48 отдельными ячейками 35х30mm. Если фабричную плашку с ячейками купить нельзя, ячейки можно нарезать самому из какого-нибудь тонкого пластика (стерилизовать спиртом и ультрафиолетом).
Неравномерный рассев. Например, мысленно разделить ячейку на три части (допустим, левую среднюю и правую). Нанести две капли по 10µl SOC в левую и среднюю части. Каплю с клетками нанести в правую часть (всё/ кроме приблизительно пары микролитров). Оставшуюся пару микролитов внести в среднюю каплю и пару раз пипетировать. Из пипетированной средней капли отобрать 1µl и перенести в левую каплю. Растирать пластиковой петлёй слева направо.
п. 19.
В каждой ячейке вырастает около сотни колоний.
Что делать дальше — зависит от поставленной задачи. Если требуется проклонировать ПЦР-продукты с точностью до "размера на форезе", удобнее выколоть сразу по паре-тройке клонов, подрастить их в 96- или 384-луночной плашке, переколоть репликатором в плашку с ПЦР-смесью, проверить, что получилось с помощью ПЦР и выбрать подходящие клоны.
Если требуется клонирование с проверкой последовательности сиквенсом, то при достаточно большом количестве клонов имеет смысл выкалывать лишь по одной колонии для каждого фрагмента (плашку хранить в холодильнике). После первого раунда сиквенса большая часть клонов окажется правильной, а для неправильных имеет смысл выколоть уже по нескольку клонов и проверять их сначала на соответствие по размеру, а потом уже сиквенировать.
Когда ради проверки чистоты клонирования/выращивания в 384-луночной плашке мы рассеяли несколько десятков клонов ещё раз, то в некоторых случаях выросли явно гетерогенные колонии (например - примерно половина колоний чисто белые, а другая половина - голубоватые или колонии нескольких дискретных размеров). Бог знает, почему так происходит — проверка сиквенированием показала, что несмотря на различный внешний вид колонии во всех случаях содержали идентичные вставки.
D-topo и topo Kits Invitrogen`а вещь хорошая и удобная. Но срок их хранения весьма ограничен, а вектор капризная штука. Перестает работать если передержать хоть чуток на тепле. Основная проблема - это некачественная транспортировка нашими поставшиками invitrogena (Хеликон). Ни разу не получил компетентные клетки - (входят в состав кита, OneShot)- в неразмороженном варианте. Метод борьбы - в госконтракт прописываем отдельным пунктом что поставщик обязуется заменить товар в случае обнаружения содержимого криоампул вне зоны заводской фасовки. Хотя лучше комптентные клетки готовить самому.
RJ Dio/22.06.2008 15:38/
компетешки и ТА-вктора почти всегда тухлые. По последнему предмету имел опыт с Ферментасом- купил, сделал-что чашка, что литовское небо, голубое-голубое, ни облачка
Гость/15.08.2008 12:37/
Люди !!! Помогите со ссылкой на тех, кто прогдает оборудование (микролабратории) для так называемого меристемного размножения растений (или как говорят микроклонирование). Заранее спасибо... Семен.
MolBiol.ru >
Методы >
Клонирование > Микроклонирование
Zbio-wiki
Дополнить