Главная страница MolBiol.ru > Методы > Разное > Разделение одно- и двухцепочечной DNA Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Разделение смеси одноцепочечной и двухцепочечной DNA на silica spin колонках

 
  1. добавить к смеси ssDNA и dsDNA 4x объём PB4;
  2. тщательно смешать и нанести на "колонку 1" (ЦФ 0.5 – 1');
  3. элюат собрать;
  4. "колонку 1" промыть 400ml PB4; (ЦФ 1 – 2');
  5. элюат смешать с 0.5 объёмами MgB (относительно объёма элюата) и нанести на "колонку 2";
  6. каждую колонку дважды промыть 400µl WB;
  7. убрать элюат из 2ml пробирок-резервуаров и высушить колонки ЦФ 2';

  8. элюция DNA:
  9. поместить колонки в чистые 1.5ml микроцентрифужные пробирки;
  10. нанести на колонки ~30µl EB, инкубировать >1';
  11. центрифугировать 2'.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9977

    Растворы

    PB4

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    EDTA0.1M0.5M2.0ml10.0ml
    H2O mQ3.5ml17.5ml

    MgB (Mg buffer)

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    MES, pH 5.5100mM1M1.0ml5.0ml
    MgCl2250mM1M2.5ml12.5ml
    Triton X-1000.5%10%0.5ml2.5ml
    H2O mQ1.5ml7.5ml

    MES, pH 5.5, 1M

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    MES (Na)1M217.2g/M2.17g10.86ml
    Укс. к-та (лед.)853mM17.4M0.49ml2.45ml
    H2O mQ   

    WB

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    Этанол80%100%8.0ml40.0ml
    TrisCl, pH7.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ1.9ml9.5ml

    EB

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    TrisCl, pH8.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ9.9ml49.5ml


    Комментарии

    Общие

  • В этом протоколе используется свойство буфера PB4 адсорбировать на стекло только двухцепочечную ДНК. Буфер состоит из GuSCN и EDTA. Именно EDTA обеспечивает отмывку от одноцепочечных нуклеиновых кислот. Фактически, это адаптация метода из (Beld M, Sol C, Goudsmit J, Boom R. Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. // Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1;24(13):2618-9.) для silica центрифужных колонок.
         На рисунке - пример использования метода. Дорожки (1) и (2) - исходная ДНК (двухцепочечная pGEM4Z и одноцепочечная pBluescript II SK(+)); (3) - смесь; (4) и (5) - элюированная ds и ss ДНК.
  • Изготовление silica spin колонок описывается в протоколе "Очистка pDNA на silica spin колонках". Там же описаны проблемы, которые может вызвать очистка на стеклянных мембранах (ингибирование некоторых ферментов).
  • Все промывки можно проводить не только на центрифуге, но и с помощью вакуумной промывалки.

  • По пунктам

    п. 5.

  • Mg2+ из MgB нейтрализует действие EDTA и, кроме того, понижает pH раствора.
  • п. 6.

  • WB. Это - забуференный 80% этанол. Он используется для того, чтобы отмыть мембрану от хаотропных солей. Tris — необходимый компонент WB, так как чистый 80% этанол денатурирует двухцепочечную ДНК во время промвки.
  • п. 9.

  • EB. Низкосолевой буфер с pH в районе 7.0 - 8.5. В принципе, можно использовать просто воду, но нужно убедиться, что её pH находится в указанных пределах.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler