Комментарии

По отдельным компонентам.

Буфер

MgCl₂

Т.о. слишком низкая концентрация Mg²⁺ - низкий выход, слишком высокая - множество полос неспецифической амплификации.

dNTP’s

Primer’s

Мы всегда полагали, что Taq-pol добавляет А к любому тупому концу, но есть статья, где сообщается, что это зависит от 3'-конца. Добавляется:

G - если на 3'-конце G;
A - если на 3'-конце C, T, A, причем весьма плохо, если последний нуклеотид A.
=> Лучше, если праймеры не начинаются на С или Т.

Polymerase

Taq pol.

Если используется слишком маленькое количество Taq, выход продукта снижается, причем это снижение тем серьезнее, чем больше размер продукта. Не стоит использовать и слишком большой избыток Taq pol. При этом вначале появляются высоко- и низкомолекулярные шмеры (превышение ~2-4 раза), а затем весь продукт становится чрезвычайно маленьким (превышение ~4-16 раз).

Pfu pol.

Оптимум концентраций для Pfu polymerase существенно уже, чем для Taq. В случае (весьма редком), когда требуется провести амплификацию с Pfu pol. мы предпочитаем сразу ставить небольшой ряд разведений.

Хорошо известно, что из-за того, что Taq полимераза с высокой частотой включает неправильные нуклеотиды для правильного определения последовательности нужно сиквенировать не одну клонированную матрицу, а несколько. Но!!! Это касается только клонированных PCR-продуктов. Если PCR-продукты сиквенировать непосредственно, то последовательность получается точной, т.к. для того, чтобы обнаружить мутацию, она должна присутствовать в >10% матриц. Это возможно лишь в том случае, если мутация произошла в первом цикле, а матриц при этом было не более 5 штук.

Матрица

Достаточно ~ 22-25 циклов, чтобы довести PCR до насыщения, если матрица - другой PCR-продукт, разбавленный в ~ 10⁶раз (учитывая и финальное разведение в самой реакции: например, развести PCR продукт в 16 000 раз и использовать 1µl разведения на 30 µl новой PCR-реакции). Внимание! Такие разведения требуют использования какого-либо агента, предотвращающего неспецифическую сорбцию на стенках пробирки: tRNA или какой-либо совместимой с PCR реакцией DNA в концентрациях ~ 0.1µg/ml.

1. геномная DNA млекопитающих => <0.5-1µg;
2. геномная DNA бактерий => ~1-10ng;
3. DNA фага лямбда => достаточно 1µl из 200µl элюции одиночной бляшки;
4. плазмидная DNA =>
1. 0.1-1.0µl ночной культуры,
2. совсем небольшое (на зубочистке) количество материала колонии;
3. ~50ng очищенной суперскрученной DNA (такое большое количество берется из-за того, что pDNA - кольцевая и при понижении температуры она ренатурирует, не оставляя праймеру шанса связаться с ней. Если хочется уменьшить количество вносимой pDNA, нужно проводить предварительную щелочную денатурацию:
1. pDNA (V<~4µl) в ТЕ, + 1µl 1N NaOH;
2. 65-85^oC, 5' ;
3. резко охладить до 0^oС или заморозить:
4. + 1µl 1N HCl.

Буфер для внесения