Real-time PCR - это семейство методик количественного PCR со следующими чертами:

1. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.
2. Построение по этим данным кинетической кривой PCR.
3. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 1). В ней можно выделить три стадии:

1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
3. Плато (стадию насыщения).

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:

где P_n - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P₀ - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция P_C(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:

Т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

1. Общий принцип real-time PCR