MolBiol.ru > Методы > Real-time PCR > Обработка данных | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
9. Обработка данных
Методы обработки данных real-time PCR основаны на применении уравнения 3: C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E (3)
Два основных принципа обработки данных Real-time PCR - это: 9.1. Метод калибровочного графика Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах. Точность метода зависит от того, насколько условия PCR (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям PCR экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами: Если достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях, когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифицируемого фрагмента в реакционной смеси, имеет смысл при наладке эксперимента приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффективности. Например, при наладке real-time PCR-анализа в иммунопреципитации хроматина (СhIP) имеет смысл приготовить несколько разведений как иммунопреципитированного препарата (IP), так и total input chromatin и сравнить эффективности амплификации. Однако приготовление серии стандартов непосредственно из экспериментального образца таит в себе две опасности, которые могут привести к низкой достоверности линейной аппроксимации данных. Во-первых, концентрация субстрата в образце может быть недостаточно высокой для того, чтобы при разведении в 8-10 раз давать достоверные результаты. В этом случае можно попробовать сконцентрировать образец. Во-вторых, содержание примесей в препарате может негативно отражаться на эффективности реакции, в то время как разведение препарата будет уменьшать концентрацию примесей и, соответственно увеличивать эффективность. Если есть подозрение, что такое эффект имеет место, можно попробовать проводить реакции в большем объеме и/или начинать с большего разведения. Такие же условия необходимо будет использовать и при проведении PCR с экспериментальными образцами. В тех случаях, когда требуется оценить "абсолютное" количество субстрата, выбор стандартов для градуировочного графика представляет собой более сложную задачу, поскольку с одной стороны, необходимо знать точное число. Для определения количества матрицы в RT-PCR предложены следующие варианты стандартов: При использовании очищенных препаратов в реакцию всегда необходимо добавлять неспецифические ДНК, чтобы приблизить условия реакции к экспериментальным. Для RT-PCR это могут быть, например, обратные транскрипты бактериальной РНК, polyA-РНК, тРНК или рРНК. Однако насколько бы условия реакции со стандартными образцами не были приближены к экспериментальным, "абсолютное" определение по-прежнему остается расчётом относительно стандарта. 9.2. Прямое сравнение данных Из уравнения 3 следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, относительная концентрация субстратаR = P1/P2 = E - (C(T)1-C(T)2) = E -С(T)
Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, housekeeping gene в случае RT-PCR). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью Eref. Тогда R = E -С(T)/ Eref -С(T)ref (4)
Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, приближенно можно записать: R = E -С(T)/ E -С(T)ref = E С(T)ref-С(T) (5)
И, наконец, если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, формула упрощается до вида: R= E С(T)ref - С(T) ~ 2 С(T)ref - С(T) = 2-С(T) (6)
Примечания При проведении RT-PCR в качестве REF можно использовать последовательность, соответствующую house-keeping gene, однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии house-keeping genes порой довольно значительно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации нескольких house-keeping genes (Vandesompele et al., 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averiging of multiple internal control genes ). В этой статье также приводится таблица стабильности экспрессии house-keeping genes в различных клетках человека (стабильность увеличивается сверху вниз). Таблица 1. Стабильность экспрессии house-keeping genes в зависимости от типа клеток
В статье также даны последовательности праймеров для каждого из упомянутых генов.
|
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|