Главная страница MolBiol.ru > Методы > Real-time PCR > Обработка данных Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

9. Обработка данных

a11


    Методы обработки данных real-time PCR основаны на применении уравнения 3:

    C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E     (3)

    Два основных принципа обработки данных Real-time PCR - это:
    1. Метод калибровочного графика.
    2. Прямое сравнение данных.


    9.1. Метод калибровочного графика

    Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.

    Точность метода зависит от того, насколько условия PCR (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям PCR экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами:

    1. Содержание примесей в стандартном препарате должно быть сходно с таковым в экспериментальном препарате.
    2. Доля амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК должна быть близка к таковой в экспериментальной ДНК.
    3. Серия разведений стандартной ДНК должна охватывать весь диапазон возможных концентраций субстрата в экспериментальной ДНК.

    Если достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях, когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифицируемого фрагмента в реакционной смеси, имеет смысл при наладке эксперимента приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффективности. Например, при наладке real-time PCR-анализа в иммунопреципитации хроматина (СhIP) имеет смысл приготовить несколько разведений как иммунопреципитированного препарата (IP), так и total input chromatin и сравнить эффективности амплификации.


    Однако приготовление серии стандартов непосредственно из экспериментального образца таит в себе две опасности, которые могут привести к низкой достоверности линейной аппроксимации данных.


    Во-первых, концентрация субстрата в образце может быть недостаточно высокой для того, чтобы при разведении в 8-10 раз давать достоверные результаты. В этом случае можно попробовать сконцентрировать образец.


    Во-вторых, содержание примесей в препарате может негативно отражаться на эффективности реакции, в то время как разведение препарата будет уменьшать концентрацию примесей и, соответственно увеличивать эффективность. Если есть подозрение, что такое эффект имеет место, можно попробовать проводить реакции в большем объеме и/или начинать с большего разведения. Такие же условия необходимо будет использовать и при проведении PCR с экспериментальными образцами.


    В тех случаях, когда требуется оценить "абсолютное" количество субстрата, выбор стандартов для градуировочного графика представляет собой более сложную задачу, поскольку с одной стороны, необходимо знать точное число. Для определения количества матрицы в RT-PCR предложены следующие варианты стандартов:

    1. Очищенный RT-PCR-продукт.
    2. Рекомбинантная ДНК.
    3. Рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией.
    4. Синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.

    При использовании очищенных препаратов в реакцию всегда необходимо добавлять неспецифические ДНК, чтобы приблизить условия реакции к экспериментальным. Для RT-PCR это могут быть, например, обратные транскрипты бактериальной РНК, polyA-РНК, тРНК или рРНК. Однако насколько бы условия реакции со стандартными образцами не были приближены к экспериментальным, "абсолютное" определение по-прежнему остается расчётом относительно стандарта.



    9.2. Прямое сравнение данных

    Из уравнения 3 следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата

    R = P1/P2 = E - (C(T)1-C(T)2) = E -С(T)


    Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, housekeeping gene в случае RT-PCR). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью Eref. Тогда

    R = E -С(T)/ Eref -С(T)ref     (4)


    Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, приближенно можно записать:

    R = E -С(T)/ E -С(T)ref = E С(T)ref-С(T)     (5)


    И, наконец, если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, формула упрощается до вида:

    R= E С(T)ref - С(T) ~ 2 С(T)ref - С(T) = 2-С(T)     (6)


    Примечания
    1. Свободно распространяемая программа REST выполняет расчеты по формуле 4 с дополнительным статистическим анализом для определения средних значений C(T).
    2. Необходимо иметь в виду далеко не всегда условия эксперимента позволяют сделать допущения, необходимые для расчета по формулам 5-6 .

    При проведении RT-PCR в качестве REF можно использовать последовательность, соответствующую house-keeping gene, однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии house-keeping genes порой довольно значительно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации нескольких house-keeping genes (Vandesompele et al., 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averiging of multiple internal control genes ). В этой статье также приводится таблица стабильности экспрессии house-keeping genes в различных клетках человека (стабильность увеличивается сверху вниз).

    Таблица 1. Стабильность экспрессии house-keeping genes в зависимости от типа клеток

    Neuro-blastomaFibroblast marrowLeukocyte poolBoneNormal
    B2MHMBSACTBACTBB2M
    RPL13AB2MHMBSB2MACTB
    ACTBRPL13AHPRT1HMBSYWHAZ
    TBPSDHASDHATBPRPL13A
    YWHAZTBPTBPSDHAUBC
    HMBSACTBRPL13AGAPDTBP
    UBCUBCGAPDHPRT1HPRT1
    SDHAYWHAZB2MYWHAZHMBS
    HPRT1-GAPDHPRT1-GAPDUBC-YWHAZUBC-RPL13ASDHA-GAPD

    В статье также даны последовательности праймеров для каждого из упомянутых генов.



    предыдущая часть 9. Обработка данных следующая часть




MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 22769




    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler