Главная страница MolBiol.ru > Методы > Геномная ДНК > Выделение ДНК из культуры клеток Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение геномной DNA с Dispase II

  1. гомогенизировать материал в эппендорфе в 100µl LB;
  2. довести объем тем же буфером до 700µl;
  3. добавить RNase А (конечная концентрация 100µg/ml), инкубировать 1h на 37oC;
  4. добавить Dispase II, инкубировать 3h 56oC, перемешивая время от времени (можно ON);
  5. экстрагировать до исчезновения интерфазы Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1);
  6. экстрагировать Хлороформ:Изоамиловый спирт (24:1);
  7. добавить 3V EtOH, ЦФ 15', на максимальной скорости;
  8. промыть 70% EtOH 96% EtOH, высушить и растворить в воде.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 11752

    Растворы

    LB (Lisis Buffer)

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    NaCl0.1M5M2.0ml10.0ml
    Сахароза5%(w/v)тв.5.0g25.0g
    Tris Cl, pH 9.10.1M1M10.0ml50.0ml
    EDTA50mM0.5M10.0ml50.0ml
    SDS0.5%(w/v)10%(w/v)5.0ml25.0ml
    H2O mQ69.7ml348.5ml


    Комментарии

    Общие

  • Достоинства: очень дешевая и эффективная протеаза. Метод хорошо работает на мухах и их тканях, не вижу препятствий для использования в других целях. Недостатки не отмечены.


  • По пунктам

    п. 2.

  • Если ткани не очень "крепкие", можно это делать с помощью инсулинового шприца на 1ml (с иглой толщиной 0.4mm) сразу в 700µl LB.
  • п. 3.

  • Если не жалко, можно и больше, лишь бы RNase была хорошая (DNase free).
  • п. 4.

  • Dispase II (Roche #165859), 5g фасовка стоит 123€(!). Готовится как стоковый раствор 100mg/ml. Инкубировать 1.5h на 37oC, после чего можно использовать. Лучше всегда делать свежую, хранить на +4oC не больше недели (советую не хранить). Я добавляю 15-20µl этого раствора на одну реакцию и инкубирую ON.
  • п. 5.

  • Если не нужны особо длинные молекулы, можно поболтать вполне ощутимо. Чем мельче будут капли фенола в водной фасе, тем чище будет DNA на выходе.
  • п. 7.

  • Можно осаждать при -20oC или -70oC 1h и 15', соответственно.
  • п. 8.

  • Осадок после преципитации должен быть нормальным, светлого цвета. Если выпал не осадок, а полужидкая сопля, вам её не удастся промыть как следует, и DNA будет с грязью. В этом случае помогает несколько раз помыть 70% спиртом, интенсивно взбалтывая до тех пор, пока сопля не разболтается в спирте и после очередного центрифугирования не превратится в нормальный осадок. С DNA от этого ничего страшного не произойдет. После этого надо промыть 96%EtOH и растворить. Если ничего не помогает, надо растворить как есть и переосадить ещё раз с NaOAc.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler