Главная страница MolBiol.ru > Методы > RNA > RNA из клеточных культур Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение RNA из культур клеток

 
  1. 2х промыть клетки 1xPBS (по ~5ml на чашку d=8cm);
  2. добавить GTB (из расчёта 5-8ml на чашку d=8cm);
  3. лизировать клетки, покачивая чашку, перенести лизат в пробирку;
  4. добавить 1/10V AcONa, 3M pH5.0;
  5. смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через 19G иглу;
  6. добавить 1V водонасыщенного (кислого) фенола, смешать;
  7. NT, ~5';
  8. добавить 1/5V Х, интенсивно смешать/вортекс (~3-4');
  9. ЦФ~1krpm, NT, 5-10';
  10. ЦФ>4krpm, NT, 10';
  11. перенести водную фазу в пробирку с 1V водонасыщенного фенола, смешать;
  12. повторить пп.7,8;
  13. ЦФ>4krpm, NT, 10';
  14. экстрагировать X:I;
  15. добавить 1V изопропанола, смешать;
  16. -20oС, 1h-ON;
  17. ЦФ>4krpm, 4oС, 10-20';
  18. сполоснуть осадок 70% EtOH;
  19. растворить в H2O (RNase free), хранить при -70oС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 15739

    Растворы

    GTB

    guanidine thiocyanate buffer (хранить в 50ml аликвотах при -20oС).

    Конц.Сток30ml50ml
    Guanidine thiocyanate4M118.16g/M14.18g23.63g
    Na citrate, pH 7.025mM1M0.75ml1.25ml
    N-Lauroylsarcosine Na0.5%10%1.5ml2.5ml
    b-MeEtOH*0.1M14.4M208µl347µl
    H2O mQ16.7ml27.8ml

    *добавлять непосредственно перед использованием.

    Na citrate

    Na3C6H5O7x2H2O (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    Na3C6H5O7x2H2O1M294.1g/M14.705g
    H2O mQ43.8ml

    p=1.17



    Комментарии

    Общие

  • В наших руках с 80mm чашки при 80% плотности получалось от 100 до 300µg тотальной RNA (в зависимости от штамма и состояния клеток).
  • Непроверенная информация На 107клеток приходится:

  • Тип клеток:total RNA ( µg):mRNA ( µg)
    NIH/3T3 cells75-2001.5-4.0
    HeLa cells100-3002-6
    CHO cells200-4003-6

    По пунктам

    п.1.

  • Отмывка клеток от ростовой среды.
  • п. 3.

  • Гуанидин тиоционат быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNase’s. Нужно убедиться, что лизис полный. Лизат можно хранить сколько угодно времени при -70oС.
  • п. 4.

  • Закисление буфера. Лишь при низком рН экстракция фенолом уводит DNA из водной фазы. Мы не знаем, почему AcNa не включён в буфер GTB, и когда готовим буфер GTB непосредственно перед использованием, мы добавляем туда AcNa сразу.
  • п. 6.

  • Нам кажется, что эффективность описываемого метода связана с тем, что при экстракции фенолом получается однофазный раствор. Разделение фаз происходит лишь при добавлении хлороформа.
  • Экстракция вязкого раствора чревата проблемами, связанными с тем, что DNA захватывает с собой RNA. При пропускании раствора через иглу шприца размер молекул DNA уменьшается до ~50 kbp. На RNA эта процедура не влияет, т.к. её размер практически всегда <20kb.
  • п.16.

  • Лучше ON.
  • п.19.

  • Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
  • Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
  • Непроверенная информация Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
    1. в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);
    2. можно наносить на форез больший объём образца;
    3. RNA можно хранить и при -20oС.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler