В наших руках с 80mm чашки при 80% плотности получалось от 100 до 300µg тотальной RNA (в зависимости от штамма и состояния клеток).
На 107клеток приходится:
Тип клеток:
total RNA ( µg):
mRNA ( µg)
NIH/3T3 cells
75-200
1.5-4.0
HeLa cells
100-300
2-6
CHO cells
200-400
3-6
По пунктам
п.1.
Отмывка клеток от ростовой среды.
п. 3.
Гуанидин тиоционат быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNase’s. Нужно убедиться, что лизис полный. Лизат можно хранить сколько угодно времени при -70oС.
п. 4.
Закисление буфера. Лишь при низком рН экстракция фенолом уводит DNA из водной фазы. Мы не знаем, почему AcNa не включён в буфер GTB, и когда готовим буфер GTB непосредственно перед использованием, мы добавляем туда AcNa сразу.
п. 6.
Нам кажется, что эффективность описываемого метода связана с тем, что при экстракции фенолом получается однофазный раствор. Разделение фаз происходит лишь при добавлении хлороформа.
Экстракция вязкого раствора чревата проблемами, связанными с тем, что DNA захватывает с собой RNA. При пропускании раствора через иглу шприца размер молекул DNA уменьшается до ~50 kbp. На RNA эта процедура не влияет, т.к. её размер практически всегда <20kb.
п.16.
Лучше ON.
п.19.
Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);
MolBiol.ru >
Методы >
RNA > RNA из клеточных культур
Zbio-wiki
Дополнить
На 107клеток приходится: