Очень удобный метод. Основное преимущество по сравнению с GTC-методом - низкая цена. К сожалению этот метод работает только для мух (причем для всех стадий развития - от эмбрионов до имаго). В случае клеток (тканей) млекопитающих получается низкий выход и RNA оказывается загрязнённой примесями геномной DNA.
взвесить мух;
в керамической ступке заморозить мух в жидком азоте, растереть в тонкий порошок, долить азот;
долить жидкий азот + "кислый фенол" из расчета 7.5ml на 1g мух;
растереть в порошок;
долить жидкий азот + SNE, столько же, сколько фенола;
растереть в порошок;
расплавить, а затем инкубировать 60oС, 10' периодически смешивая;
0oС, 2-10' (в зависимости от объёма, чтобы успело остыть);
Содержание RNA в мухах: самец ~5.3µg, самка ~7.5µg.
Выход этого метода ~3.6-4.6µg/муху.
По пунктам
п. 1.
Или сосчитать, 1 муха весит ~1mg.
п. 2-6.
Приготовление мелкодисперсной суспензии - мухи:фенол:буфер. При оттаивании фенол и SDS быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNases.
Аккуратно выливайте жидкий азот в ступку (из небольшого пластикового стаканчика), иначе разлетятся и растертые мухи и не растертые.
Обязательно работайте под хорошей тягой. Растертые в пыль мухи могут очень быстро сделать Вас аллергиком.
п. 7-9.
Надо соблюдать осторожность в п.7 и 8, если пробирка стеклянная. Центрифужные пробирки обычно толстостенные - они плохо выдерживают резкую смену температуры.
Экстракция фенолом с низким рН приводит к тому, что DNA уходит из водной фазы.
п. 9, 10.
Центрифугирование проводится в два этапа, т.к. нам не нравится, когда крупные частицы (хитин, нелизировавшие остатки мух) проходят через водный раствор с высокой скоростью (но, возможно, что здесь это не важно, т.к. раствор RNA не вязкий).
п. 14.
Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);