Содержание RNA в мухах: самец ~5.3µg, самка ~7.5µg.
Выход этого метода ~1.0-1.2µg/муху.
Центрифугирование через CsTFA даёт лучший выход ~2.2-2.3µg/муху; "подушка" на поверхности градиента не образуется (Okayama H et al., Methods Enzymol 154, 3, 1987).
По пунктам
п. 1, 15.
Приготовление мелкодисперсной суспензии - мухи:GTC. При оттаивании GTC быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNases.
Аккуратно выливайте жидкий азот в ступку (из небольшого пластикового стаканчика), иначе разлетятся и растертые мухи и не растертые.
Обязательно работайте под хорошей тягой. Растертые в пыль мухи могут очень быстро сделать Вас аллергиком.
п. 7, 22.
После осаждения через CsCl на поверхности градиента образуется плотная подушка, её можно удалить иглой или присосавшись обрезанным типчиком.
п. 11, 24.
Фенол - кислый.
п. 14.
Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);