Анализ клонов после первичного скрининга


MolBiol.ru > Методы > Библиотеки > Анализ клонов после первичного скрининга

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · ·

Zbio-wiki

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ

PCR-гибридизация первичного скрининга библиотеки

PCR-гибридизация после первичного скрининга позволяет:
а) отличить истинно-позитивные сигналы от ложно-позитивных,
б) оценить размер вставки индивидуальных клонов.

выколоть зоны локализации сигналов;
перенести их в 1.7ml микроцентрифужные пробирки, с SM/хлороформ = 500 µl/20 µl;
элюция фага 2h на качалке 37^oС или в холодильнике ON (суспензию фага хранить при 4^oС);
PCR амплификация в объёме 15 µl:
суспензию фага из п.3 ЦФ 5' NT;
в каждую PCR-пробирку добавить по 1 µl суспензии фага;
параметры PCR:

I. T_d = 95^oC, => 1';
II. 28 циклов:

T_d = 94^oC, => 10'';
T_a = 48.5^oC, => 25''
T_e = 68^oC, => 3-6';

III. T = 4^oC;

нанести PCR-реакции на 1% агарозный гель;
Саузерн-блот;
гибридизация.

MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 14628

Комментарии

По пунктам

п. 4

Использованные нами праймеры:
#T3 20b ATTAACCCTCACTAAAGGGA

#T7 20b TAATACGACTCACTATAGGG

п. 6
Хлороформ не оказывает никакого влияния на PCR-реакцию.
5х буфер для внесения позволяет сразу же вносить PCR реакции в лунки геля.
Состав буферов, относящихся к PCR смотри в "Состав PCR реакции".

п. 7

Время на этапе элонгации зависит от ожидаемой длины cDNA.

п. 10

Для гибридизации можно использовать тот же буфер, который уже был применён для первичного скрининга (предгибридизация в новом буфере, затем его слить и залить старый гибридизационный буфер, предварительно прогретый 3' в кипящей бане).

Дополнения, комментарии, вопросы

Люди знающие! Здесь недостаёт того, что знаете вы, но не знал или забыл автор. Этой страницей пользуются ваши коллеги. Пожалуйста, поделитесь с ними опытом. Пригодится всё, что поможет в работе.

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

-- как прислать био-картинку --

Дата последней модификации: 30/07/13

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ

· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·

--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---

--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru · redactor@molbiol.ru · реклама