Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Определение концентрации белка Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Bicinchoninic acid protein assay kit

 
  1. приготовить "Protein determination mix":   


  2. Количество реакций1x
    CuSO4(II), 4%4µl
    Bicinchonic acid200µl
  3. составить контрольные смеси "a"-"e":
  4.   H2O Protein determination mix Protein standart (0.2µg/µl) Количество белка (µg)
    а 10µl 200µl - 0 µg
    b 9µl 200µl 1µl 0.2µg
    c 8µl 200µl 2µl 0.4µg
    d 6µl 200µl 4µl 0.8µg
    e - 200µl 10µl 2.0µg
  5. составить экспериментальные смеси, лучше - несколько разведений:
  6. 200µl (Protein determination mix) + (образец в V=10µl);

  7. инкубировать
  8. * по методике кита 37oC, 30' (можно NT, ON),
    * по "Guide to protein purification" 60oC, 30'. Написано, что это повышает чувствительность и уменьшает белок-белковые различия;

  9. охладить до NT;
  10. измерять OD562(от низких концентраций к высоким, тогда не придется мыть ячейку);
  11. по значениям "a"-"e" построить калибровочную таблицу, рассчитать концентрации в экспериментальных образцах.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13584


    Комментарии

    Общие

    Допустимые для BCA prot. assay концентрации примесей (на 10µl).

    Кислоты и основания
    HCl0.1M
    NaOH0.1M
    PCA<1%
    TCA<1%
    Буфера
    Acetate0.2M
    (NH4)2SO420%
    Borate10mM
    Citrate<1mM
    Glycine1M
    HEPES100µM
    Phosphate250mM
    Tris0.1M
    Детергенты
    Brij 351%
    CHAPS1%
    Lubrol PX1%
    Octyl-glucoside1%
    SDS1%
    TritonX-1001%
    Tween-201%
    Восстановители
    DTT<1mM
    bMeEtOH<1%
    Miscellaneous
    DNA/RNA20µg
    DMSO5%
    EDTA10mM
    Glycerol10%
    KCl<10mM
    NaCl1M
    Sucrose40%
    Urea3M
  • Непроверенная информация Кит можно использовать для определения не только белковой, но и солевой фракции, сходящей с колонки. Для этого образец вносят на колонку с 1mM ascorbat Na (который идёт вместе с солью). В этом случае asсorbate "проявляется" сразу же после добавления "Protein determination mix", а белки - только после прогрева.


  • По пунктам

    п. 4.

  • При желании время "проявления" можно значительно сократить: пробирки поместить в водяную ванночку и обработать ~20'' в микроволновой печи на полной мощности.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Profi /13.10.2005 06:31/
    Для стандартной микрокюветы на 700 мкл я использую следующие соотношения растворов (пересчитаны из стандартного кита Сигмы): 600 мкл раствора бицинхониновой кислоты смешивают с 30 мкл 4%-ного медного купороса (5-водного сульфата меди) и с 30 мкл раствора белка с концентрацией 0,1-1,0 мг/мл. Инкубация 30 мин при 37 градусах. Я вбил калибровку на Биорадовский SmartSpec 3000 2 года назад и пользуюсь методом. Проверка показала, что калибровка работает (реактивы не протухли, спектрофотометр не умирает).



    Николай Полянский /27.05.2008 11:10/
    Уважаемые коллеги, не подскажет ли кто, в чем тут может быть дело? Я использовал вот такой метод:
    Reagents
    1. Reagent A: 8 gm sodium carbonate monohydrate, 1.6 gm sodium tartrate, brought to 100 ml with distilled water. Adjust the pH to 11.25 with 10 M NaOH.
    2. Reagent B: 4 gm BCA in 100 ml distilled water.
    3. Reagent C: 0.4 gm cupric sulfate (5 x hydrated) in 10 ml water.
    4. Working solution: Mix 1 volume reagent C with 25 volumes reagent B, then add 26 volumes reagent A to the C/B mixture.
    Assay
    1. Prepare samples containing 0.2 to 50 micrograms protein in 500 microliters.
    2. Add 500 microliters working solution to each 500 microliters sample and mix. Incubate 60 min. at 60 degrees C.
    3. Cool the samples and read at 562 nm.
    Analysis
    Prepare a standard curve of absorbance versus micrograms protein (or vice versa), and determine amounts from the curve. Determine concentrations of original samples from the amount protein, volume/sample, and dilution factor, if any. If you are unfamiliar with how to obtain a protein concentration for a diluted sample from a standard curve, see how to prepare and use a protein standard curve.
    Reference
    Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

    С альфа-кристаллином калибровка в интервале 0,5 - 20 мкг в пробе давала нормальную
    линейную зависимость, а когда я пытался постооить с БСА "Sigma", то получалось сплошное безобразие.
    Николай Полянский



    Гость /16.01.2009 14:34/
    А какой концентрации должен быть раствор бицинхониновой кислоты и какой чистоты должен быть этот реактив? Подскажите, пожалуйста.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler