Главная страница MolBiol.ru > Методы > Белки > Тестирование антител Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Dot-blot для определения рабочей концентрации антител

Георгиева София,
Институт Молекулярной Биологии

При оптимальном разведении чувствительность антител максимальна, но в тоже время они ещё не дают слишком высокого фона на BSA.

    Подготовка мембраны

    Нанесение образцов на мембрану
  1. вырезать мембрану нужного размера (по одному блоту для каждого разведения первичных антител);
  2. отметить карандашом положение образцов, так, чтобы минимальное расстояние между ними было ~1cm;
  3. смочить мембрану сначала в mQ, затем в PBS;
  4. приготовить серийные разведения белка в BSA 50ng/µl/PBS;
  5. нанести по 1-2.5µl образцов на мембрану, не касаясь её типом;
  6. подсушить мембрану;
  7. мембрану либо использовать сразу, либо хранить при 2-80С, завернутой в Saran Wrap, в течение 3 месяцев.


  8. Иммунодетекция

  9. "забивка" мембраны 1h NT на качалке;
  10. отмывка 1x15' и 2х5'в 0.1%Tween/PBS NT;
  11. приготовить несколько разведений первичных антител: 1:100, 1:250, 1:500;
  12. инкубировать 1 блот с каждым разведением 1h NT;
  13. отмыть (п.9);
  14. инкубировать со вторичными антителами 1h NT;
  15. отмыть (п.9);
  16. далее - детектировать, используя ЕCL реагенты.

    Пример: разведения рекомбинантного белка (С=4µg/µl):

  1. 1µl белка + 199µl BSA (0.1µg/µl) = 20 ng/µl (2.5µl на dot)
  2. 10µl (из п.1) + 10 µl BSA = 10 ng/µl (1µl )
  3. 4 µl (из п.2) + 16 µl BSA = 2 ng/µl (1µl)
  4. 4 µl (из п.3) + 16 µl BSA = 0.4 ng/µl (1µl)


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13536

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Pavel2 /19.10.2012 11:06/
    Зачем нужный белок разводить с БСА и наносить на мембрану? Разве БСА с белком не будет конкурировать при связывании с мембраной?








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler