1u активности определяется как такое количество фермента, которое включает 10nmol (всех четырёх) dNTP’s в кислотонерастворимую фракцию за 30' при 72oC. Обычно в качестве матрицы используется активизированная calf thymus DNA, но в наших руках она даёт неудобно низкий процент включения.
Внимание!!! Ни в коем случае нельзя судить об активности по одному измерению, т.к. слишком большое количество фермента ингибирует реакцию.
При использовании приведённого протокола % включения может доходить до 95%, но судить об активности фермента можно лишь по разведениям, которые дают не более или порядка 10% включения (иначе будет получена заниженная активность).
Активность фермента сильно зависит от буфера, в котором разводится полимераза. Если провести cерию разведений не в 1х PCR буфере, а в "буфере для разведения" полимеразы {Hepes, pH7.4 20mM; KCl 100mM; EDTA 0.1mM; Glycerol 50%; Gelatin 0.005%; DTT 1mM}, то получится в ~3 раза меньшая активность.
Такое ощущение, что "фирменные" полимеразы часто имеют более высокую активность, чем указано на этикетке (в принципе, я на их месте так бы и поступил: (i) мизерные затраты на производство фермента; (ii) плата за лицензию берётся из расчёта проданных единиц активности; (iii) продажная цена запредельно высокая. Выгоднее положить фермента побольше и сделать вид, что он гораздо лучше, чем у конкурентов.). Так что для производства "на экспорт" или при переносе старого протокола на home-made фермент имеет смысл провести в параллель измерение активности "коммерческого" фермента.
По пунктам
п.7.
На самом деле мы EDTA не добавляем. Просто держим пробирки во льду и работаем быстро.