Главная страница MolBiol.ru > Методы > Экспрессия > His6-меченные белки Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке

 

    Приготовление стоковой культуры

  1. со стока (-70oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой: {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%};
  2. отобрать 2-3 индивидуальные колонии, поместить их в 5ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в 17-50ml пробирках;
  3. растить 200-300rpm, 30(37)oC, ON;
  4. из каждой пробирки отобрать в стерильных условиях по 1ml;
  5. к оставшимся частям культуры добавить DMSO до 7%, разаликвотить по 500 µl в подписанных 1.5ml ЦФ-пробирках, заморозить в жидком азоте, хранить при -70oC;
  6. аликвоты из п.4 2х промыть 1.0ml 2xYT;
  7. ресуспензировать в 2ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM};
  8. отобрать по 200 µl (не индуцированный контроль);
  9. остальная часть 200-300rpm, 37oC, ~5h;
  10. отобрать по 200 µl (индуцированный контроль);
  11. проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе (15% разрешающий гель);


  12. Препаративная культура

  13. разморозить аликвоту из п.5, перенести её в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере двух 2L колбах;
  14. 200-300rpm, 37oC, до OD600=0.6-0.8 (но ниже 1.0!);
  15. ЦФ 4krpm, 10', NT;
  16. 2x промыть клетки 100ml 2xYT (ЦФ 4krpm, 10', NT);
  17. ресуспензировать в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM};
  18. optional
  19. отобрать 1ml (не индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения;

  20. 200-300rpm, 37oC, 5h;
  21. optional
  22. отобрать 1ml (индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения;

  23. ресуспензировать клетки в ~100ml Lysis buffer (LB), перенести в 50ml центрифужные пробирки;
  24. ЦФ 4krpm, ~5', 4oC;
  25. сбросить супернатант, взвесить осадки, ресуспензировать их в LB из расчёта 4ml на 1g осадка;
  26. заморозить в жидком азоте, хранить при -70oС;
  27. проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе;


  28. Приготовление осветлённого лизата

  29. разморозить клетки во льду ~15';
  30. добавить лизоцим до 1mg/ml, 30', 0oС;
  31. озвучить во льду (6х 200-300W с 0.5-1.0' перерывами для охлаждения между импульсами);
  32. отобрать 0.1ml (контроль перед центрифугированием);
  33. ЦФ 10krpm, ~30', 4oC;
  34. забрать супернатант, отобрать 0.5ml для определения количества e(y)2/mouse белка, остальное заморозить в жидком азоте, хранить при -70oС;


  35. Определение количества e(y)2/mouse белка и ёмкости Ni-NTA агарозы

  36. сполоснуть 0.1ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 0.5ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера;
  37. поставить аналитическую адсорбцию:
    1. 10 µl 50% Ni-NTA + 10 µl супернатанта из п.30 + 150 µl LB;
    2. 10 µl 50% Ni-NTA + 40 µl супернатанта из п.30 + 120 µl LB;
    3. 10 µl 50% Ni-NTA + 160 µl супернатанта из п.30;
  38. смешивать 1h при +4oC (холодная комната) на роторном смесителе;
  39. снять супернатант, 2х сполоснуть 0.5ml WB, снять белок с агарозы в 50 µl 100mM EDTA;
    1. сравнить выход белка окрашиванием на Whatman 3MM, нанеся 2х кратные разведения;
    2. определить концентрации белка в элюциях (а)-(в) с помощью Bicinchoninic acid protein assay kit (Но, внимание!!! Нельзя использовать больше, чем 1 µl, т.к. 10mM EDTA - предельная допустимая концентрация для этой процедуры);
  40. рассчитать, какой объём супернатанта можно очистить на 2ml 50% Ni-NTA и какое количество белка ожидается с этого получить;


  41. Препаративная очистка

    Нанесение на колонку

  42. сполоснуть 2ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 4ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера;
  43. поставить адсорбцию:
  44. 2ml 50% Ni-NTA агарозы
    "?"ml супернатанта (из расчёта п.33)
    "?"ml LB (чтобы сохранялась пропорция п.29);

  45. 1h при +4oC (холодная комната) на роторном смесителе;
  46. нанести лизат на 1ml Qiagen-колонку, собрать то, что прошло сквозь колонку;
  47. лучше прикрыть Ni-NTA агарозу в колонке верхним штифтом;
  48. промыть колонку 10ml LB, собрать то, что прошло сквозь колонку;
  49. промыть колонку 10ml WB, забрать последний ~1ml из тех, что прошли сквозь колонку;
  50. В протоколе не представлена оптимизация способа элюции с колонки. Её нужно проводить при первой очистке любого белка. При этом белок элюируется градиентом концентрации имидазола (или pH), фракции анализируются на PAAG и подбирается оптимальный состав WB и EB.


    Элюция имидазолом

  51. промыть колонку 3ml I-WB, собирать фракции по 0.5ml;
  52. элюировать белок 3ml I-EB, собирать фракции по 0.5ml;


  53. Элюция кислым буфером

  54. промыть колонку 3ml A-WB, собирать фракции по 0.5ml;
  55. элюировать белок 3ml A-EB, собирать фракции по 0.5ml;
  56. проанализировать на форезе ход очистки, объединить фракции элюата, содержащие основное количество рекомбинантного белка, определить выход белка;
  57. если не требуется вносить коррективы - вымыть Ni-NTA агарозу из колонки и провести очистку оставшегося осветлённого лизата;
  58. определить количество и качество белка в индивидуальных раундах очистки, подписать пробирки, заморозить в ж. азоте, хранить на -70oС.
  59. регенерировать Ni-NTA агарозную колонку, подписать когда и для очистки какого белка она использовалась, хранить на +4oС.


  60. Регенерация Ni-NTA агарозы (для 1ml колонки)

  61. промыть колонку 4ml RB;
  62. промыть колонку 5ml H2O;
  63. промыть колонку 3ml 2% SDS;
  64. промыть колонку 1ml 25% EtOH;
  65. промыть колонку 1ml 50% EtOH;
  66. промыть колонку 1ml 75% EtOH;
  67. промыть колонку 5ml 100% EtOH;
  68. промыть колонку 1ml 75% EtOH;
  69. промыть колонку 1ml 50% EtOH;
  70. промыть колонку 1ml 25% EtOH;
  71. промыть колонку 1ml H2O;
  72. промыть колонку 5ml 100mM EDTA, pH8.0;
  73. тщательно промыть колонку 20ml H2O;
  74. перезарядить колонку 2ml 100mM NiSO4
  75. промыть колонку 2ml H2O;
  76. промыть колонку 2ml 25% EtOH;
  77. заполнить колонку до половины 25% EtOH;
  78. хранить при +4oС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 14950



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Растворы

    Lysis buffer (LB)

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH8.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH8.0*20mM1M1.0ml
    H2O mQ43.5ml

    Wash buffer (WB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH6.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH6.0*20mM1M1.0ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ38.5ml

    Imidazole wash buffer (I-WB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH6.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH6.0*150mM1M7.5ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ32.0ml

    Imidazole elution buffer (I-EB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH6.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH6.0*450mM1M22.5ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ17.0ml

    * Имидазол обладает значительной буферной ёмкостью, поэтому нужно заранее доводить его pH.

    Acid wash buffer (A-WB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH5.350mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ39.5ml

    Acid elution buffer (A-EB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH4.550mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ39.5ml

    Regeneration buffer

    Конц.Сток50ml
    Guanidine HCl6M95.53g/M28.66g
    Acetic acid0.2M17.4M0.57ml
    H2O mQ  

    NiSO4 1M

    Конц.Сток10ml
    NiSO46H2O1M262.8g/M2.62g
    H2O mQ  


    Комментарии

    Общие

  • Как и любой другой белок, ey2 нужно чистить при +4oС, т.е. в холодной комнате.


  • По пунктам

    п. 1-11.

  • Клон-продуцент может быть нестабилен, поэтому необходим этап селекции.
  • п. 1.

  • 2% глюкоза выступает здесь как репрессор lac промотора (под контролем которого находится экспрессируемый ген). Катаболитная репрессия - хоть и очень простой метод, но вполне действенный: на чашках с 2% глюкозой сине-белый тест не работает.
  • п. 3.

  • Инкубация при 30oС - чтобы культура не перерастала.
  • п. 6.

  • Промывка 2xYT, чтобы перед индукцией избавиться от глюкозы. 2х промывка проводится следующим образом:
    1. поместить 1ml культуры в стерильную 1.5ml ЦФ-пробирку;
    2. ЦФ либо 2' при 6krpm (в микроцентрифуге с регулируемой скоростью вращения), либо 10'' при 14krpm;
    3. убрать супернатант, бактерии ресуспензировать на вортексе в 1.0ml 2xYT;
    4. повторить: п.2, 3;

    п. 8, 10.

  • Отобранные 200 µl осадить на ЦФ (10-30'') и ресуспензировать в 20 µl {1х буфера для внесения}. Чтобы не образовывалось трудно растворимых комков лучше вначале ресуспензировать в 10 µl H2O, а потом добавить 10 µl 2х буфера.
  • п. 9, 18.

  • Время индукции можно увеличить в ~два раза, но это не приведёт к увеличению количества рекомбинантного белка.
  • п. 11.

  • Чтобы получить нормальную картинку достаточно взять 3 µl на 2.5х0.75mm2 форезную ячейку. Но, в первый раз мы бы посоветовали наносить образцы на гель тремя блоками:
  • 3х количество => 9 µl;
    1х количество => 3 µl;
    0.3х количество => 1 µl.

    В этом случае вы наверняка получите хорошую картинку хотя бы на одном из блоков. Количество материала, которое даст приемлемую картинку на форезе можно так же оценить с помощью предварительной окраски серийных разведений на Whatman 3MM.

  • На форезе вы должны увидеть жирную полосу (~20% от всего белка на дорожке) в районе 10kDa.
  • п. 15.

  • Отмывку проводить в металлических ЦФ стаканах. Перед этим стаканы и пластиковые крышки тщательно вымыть, протереть спиртом и высушить под UV(стерилизация). Ресуспензирование и т.п. проводить на столе (не под ламинаром), но нужно делать это чисто.
  • п. 22.

  • Сбрасывать супернатант в два этапа: сначала слить, провести повторное центрифугирование ~1-2', остатки жидкости отсосать.
  • п. 25.

  • Можно размораживать и в бане при комнатной температуре, НО!!! С непрерывным перемешиванием и перенести в ледяную баню, когда в пробирке ещё останется ~10% льда.
  • п. 27.

  • Раствор должен стать слабо вязким после озвучивания.
  • п. 34.

  • При споласкивании Ni-NTA её можно осаждать низкоскоростным центрифугированием:
  • для микроцентрифуги - 30'' при 3krpm;
    для препаративной центрифуги - 2' при 2krpm.

    п. 37.

  • В пределах ёмкости Ni-NTA агарозы количество полученного белка должно увеличиваться пропорционально исходному количеству.
  • Только для ориентировки!: у нас получалось ~80 µl супернатанта на 10 µl 50% Ni-NTA агарозы.
  • п. 37.

  • Предварительно залить в колонку ~5ml LB, дать стечь.
  • п. 41.

  • Верхний штифт вводить либо перевернутым желтым типом, либо обрезанной 1ml пипеткой.
  • п. 48.

  • На форез нужно нанести
  • а) материал из пунктов 28, 30, 37, 39, 40,
    б) равные объёмы (~1 µl) из фракций пунктов 41, 42 или 43,44.

    Объёмы материала из п. 28, 30, 37, 39, 40 нужно скорректировать с учётом разбавления в п.35.
    Например, если 10 µl 50% Ni-NTA агарозы связывают количественно рекомбинантный белок из 80 µl супернатанта: адсорбция:

    2ml 50% Ni-NTA агарозы
    16ml супернатанта
    16ml LB

    => объёмы из п. 37, 39, 40 в 2.1 раза больше, чем из п. 28, 30.

    п. 49.

  • Для экономии времени в следующих раундах, очистку можно контролировать не на форезе, а по окрашиванию аликвот на Whatman 3MM.
  • Рекомбинантный белок, очищенный в каждом раунде нужно объединить в отдельной пробирке, для каждой определить концентрацию белка (Bicinch. kit) и проконтролировать его качество на отдельной дорожке PAAG. Лишь когда качество индивидуальных очисток будет проконтролировано на форезе, можно объединить материал в одной пробирке.


  • Экспрессирующая конструкция

    Открытая рамка считывания мышиного e(y)2 гена клонирована по BamHI-HindIII сайтам в pQE30 вектор (Qiagen); аминокислотная последовательность рекомбинантного белка:

    MOUSE E(Y)2 PROTEIN, RECOMBINANT,
    EXPRESSED IN E.COLY AS 6HIS FUSION
    SEQUENCE 113 AA; 12927 MW;

    MRGSHHHHHH GSMVVSKMNK DAQMRAAINQ KLIETGERER LKELLRAKLI ECGWKDQLKA
    HCKEVIKEKG LEHVTVDDLV AEITPKGRAL VPDSVKKELL QRIRTFLAQH ASL

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Nameless /22.08.2005 22:55/
    BCA protein assay вообще довольно чувствителен к имидазолу (для micro допускается 12.5 мМ, macro - 50 mM). У меня например белки снимаются в основном 250 мМ имидазолом, т.е. в микро-модификации разведение 1:10 уже не катит, а 1:20 - на пределе допустимой концентрации. Советую для белков в имидазоле использовать BioRad Protein assay kit.



    Fedo /24.08.2005 00:48/
    Spasibo tebe Nameless. Kak raz predstoit skoro chistit' belok s 6His... A v labe toka BCA protein assay. Budem vybivat' BioRadovskij Kit ))



    Nameless /24.08.2005 17:29/
    Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось.



    Nameless /24.08.2005 18:50/
    Да, кстати о птичках. Тут на днях наши звонили в Biorad и получили информацию что пластиковые эппендорфы при нагревании до 60 градусов (как это рекомендуется в ВСА assay) выделяют вещество которое поглощает как раз в том диапазоне волн в котором рекомендуется проводить измерения (562). Так что НА САМОМ ДЕЛЕ они рекомендуют или ставить при 37 в пластике или при 60 но в стеклянных пробирках. Вот такие пироги.
    Так что если у кого результаты не сходятся - звоните в биорад, получайте ответ - и бегом к шефу smile.gif wink.gif beer.gif



    Guest /24.08.2005 19:17/
    так там калибровка делается в тех же условиях, так что весчество везде выделяется - и в опыте и в контрольных образцах



    Nameless /25.08.2005 21:07/
    Оно то понятно, но ведь хрен же его знает, как на него повлияет наличие вашего белка и компонентов буфера в котором он растворён.



    _enisseisk_ /11.01.2006 03:57/
    1. вообще-то все то же самое можно делать и в денатурирующих условиях - см. напр., протокол(ы) на <a href="http://www.qiagen.com." target="_blank">www.qiagen.com.[/url] Это может быть полезным в случае, когда белок плохо растворимый, подвергается агрегации итп. Выходы при этом - выше, а белок можно потом диализовать, если нужно.
    2. с нативной очисткой - тоже должно все работать, но можно при лизисе (озвучивание во льду) добавлять еще и ингибиторы протеаз, например, ФМСФ до 100 мкМ. Остальные - дело вкуса.
    3. тип сорбента - тоже может иметь значение. Qiagen-овские неплохи, но и от Sigma (Ni-CAM HC) ничего. И для FPLC годится.



    serhiosus /05.05.2007 15:18/
    Вопрос. Насколько я понимаю, глюкоза не мешает индукции с помощью IPTG (сам индуцирую 0,5 мМ IPTG при наличии в среде 0,5% глюкозы). Зачем тогда уксложнять процедуру индукции за счет отмывки клеток?



    Esya /06.05.2007 23:48/
    (Nameless @ 24.08.2005 15:29)
    Ссылка на исходное сообщение  Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось.

    Ага, если белок кумассей красится, то бредфорд завсегда лучше, не надо забывать, что мелочь всякая зачастую плевать на биорадовскую краску в кислоте хотела. А БСА он без претензий, все меряет и даже альбумин можно в качестве стандарта часто использовать.



    Гость /08.05.2007 10:56/
    Подскажите пожалуйста при работе с Ni-NTA колонкой можно ли использовать ДТТ или β-меркаптоэтанол



    Tom1 /08.05.2007 13:33/
    НЕТ



    Kaa-g /08.05.2007 14:15/
    А по-моему β-меркаптоэтанол можна, у меня лизис буфер с β-меркаптоэтанол и белок выделяется и колонку использовал несколько раз лаж небыло еще, а вот ДТТ однозначно нельзя.



    Гость /08.05.2007 14:40/
    А почему, что там происходит??
    Дело в том, что хроматография на Ni-NTA прошла с ДТТ и все поделилось и почистилось, но только в процессе работы колонка из зеленовато голубой превратилась в бурокоричневую, но потом при отмывке имидазолом, эта бурая окраска сошла с белком и теперь препарат белка светлокоричневый. А колонка опять нормального цвета.
    Разница между βмэ и ДТТ только в дополнительных SH и ОН группах следовательно и реакция ионов никеля будет с ними одинаковой???
    А как же работают на Ni-NTA с белками, которым нужны ДТТ и βмэ???



    Tom1 /08.05.2007 15:42/
    меняют ДТТ и мео на цистеин....



    Esya /08.05.2007 16:03/
    мео можно аж до 20 мМ - иногда размер, то есть число групп, важен smile.gif ДТТ - хелатор, а МЭО - нет tongue.gif
    Еще можно TCEP - пользовать

    Это если никелевый сорбент пользовать, кобальтовый и МЕО плохо переносит по другим причинам. Читайте инструкцию.



    bio-1985 /05.09.2007 17:02/
    Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?



    Гость /09.01.2008 19:29/
    "Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?"

    посмотрите на 23 стр этого протокола:

    http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB273.pdf ( http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB273.pdf )



    Гость /09.01.2008 19:35/
    "Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись?"

    EDTA 1mM
    EGTA 0.5mM
    20% glycelol, можно до 50% glycerol (тогда колонку после нанесения элюирующего буфера лучше центрифугировать).



    guest: ммм /09.01.2008 22:43/
    Дык есть коктейли из ингибиторов. Но ..., Что еще? Температуру пониже все делать на 0-4С, для хранения белок лиофилизовать хранить на -70 в двойной герметичной таре, в наружной таре держать активированный селикагель.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler