MolBiol.ru > Методы > Экспрессия > His6-меченные белки | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке
Приготовление стоковой культуры отобрать 1ml (не индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения; отобрать 1ml (индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения; Приготовление осветлённого лизата Определение количества e(y)2/mouse белка и ёмкости Ni-NTA агарозы 2ml 50% Ni-NTA агарозы В протоколе не представлена оптимизация способа элюции с колонки. Её нужно проводить при первой очистке любого белка. При этом белок элюируется градиентом концентрации имидазола (или pH), фракции анализируются на PAAG и подбирается оптимальный состав WB и EB. Регенерация Ni-NTA агарозы (для 1ml колонки) |
Смотри также: /ссылки на сетевые ресурсы/
|
п. 1-11. п. 1. п. 3. п. 6. п. 8, 10. п. 9, 18. п. 11. 3х количество => 9 µl; В этом случае вы наверняка получите хорошую картинку хотя бы на одном из блоков. Количество материала, которое даст приемлемую картинку на форезе можно так же оценить с помощью предварительной окраски серийных разведений на Whatman 3MM. п. 15. п. 22. п. 25. п. 27. п. 34. для микроцентрифуги - 30'' при 3krpm; п. 37. п. 37. п. 41. п. 48. а) материал из пунктов 28, 30, 37, 39, 40, Объёмы материала из п. 28, 30, 37, 39, 40 нужно скорректировать с учётом разбавления в п.35. 2ml 50% Ni-NTA агарозы => объёмы из п. 37, 39, 40 в 2.1 раза больше, чем из п. 28, 30. п. 49. Открытая рамка считывания мышиного e(y)2 гена клонирована по BamHI-HindIII сайтам в pQE30 вектор (Qiagen); аминокислотная последовательность рекомбинантного белка: MOUSE E(Y)2 PROTEIN, RECOMBINANT, MRGSHHHHHH GSMVVSKMNK DAQMRAAINQ KLIETGERER LKELLRAKLI ECGWKDQLKA Дополнения, комментарии, вопросы Nameless /22.08.2005 22:55/
BCA protein assay вообще довольно чувствителен к имидазолу (для micro допускается 12.5 мМ, macro - 50 mM). У меня например белки снимаются в основном 250 мМ имидазолом, т.е. в микро-модификации разведение 1:10 уже не катит, а 1:20 - на пределе допустимой концентрации. Советую для белков в имидазоле использовать BioRad Protein assay kit. Fedo /24.08.2005 00:48/
Spasibo tebe Nameless. Kak raz predstoit skoro chistit' belok s 6His... A v labe toka BCA protein assay. Budem vybivat' BioRadovskij Kit )) Nameless /24.08.2005 17:29/
Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось. Nameless /24.08.2005 18:50/
Да, кстати о птичках. Тут на днях наши звонили в Biorad и получили информацию что пластиковые эппендорфы при нагревании до 60 градусов (как это рекомендуется в ВСА assay) выделяют вещество которое поглощает как раз в том диапазоне волн в котором рекомендуется проводить измерения (562). Так что НА САМОМ ДЕЛЕ они рекомендуют или ставить при 37 в пластике или при 60 но в стеклянных пробирках. Вот такие пироги. Так что если у кого результаты не сходятся - звоните в биорад, получайте ответ - и бегом к шефу Guest /24.08.2005 19:17/
так там калибровка делается в тех же условиях, так что весчество везде выделяется - и в опыте и в контрольных образцах Nameless /25.08.2005 21:07/
Оно то понятно, но ведь хрен же его знает, как на него повлияет наличие вашего белка и компонентов буфера в котором он растворён. _enisseisk_ /11.01.2006 03:57/
1. вообще-то все то же самое можно делать и в денатурирующих условиях - см. напр., протокол(ы) на <a href="http://www.qiagen.com." target="_blank">www.qiagen.com.[/url] Это может быть полезным в случае, когда белок плохо растворимый, подвергается агрегации итп. Выходы при этом - выше, а белок можно потом диализовать, если нужно. 2. с нативной очисткой - тоже должно все работать, но можно при лизисе (озвучивание во льду) добавлять еще и ингибиторы протеаз, например, ФМСФ до 100 мкМ. Остальные - дело вкуса. 3. тип сорбента - тоже может иметь значение. Qiagen-овские неплохи, но и от Sigma (Ni-CAM HC) ничего. И для FPLC годится. serhiosus /05.05.2007 15:18/
Вопрос. Насколько я понимаю, глюкоза не мешает индукции с помощью IPTG (сам индуцирую 0,5 мМ IPTG при наличии в среде 0,5% глюкозы). Зачем тогда уксложнять процедуру индукции за счет отмывки клеток? Esya /06.05.2007 23:48/
(Nameless @ 24.08.2005 15:29) Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось. Ага, если белок кумассей красится, то бредфорд завсегда лучше, не надо забывать, что мелочь всякая зачастую плевать на биорадовскую краску в кислоте хотела. А БСА он без претензий, все меряет и даже альбумин можно в качестве стандарта часто использовать. Гость /08.05.2007 10:56/
Подскажите пожалуйста при работе с Ni-NTA колонкой можно ли использовать ДТТ или β-меркаптоэтанол Tom1 /08.05.2007 13:33/
НЕТ Kaa-g /08.05.2007 14:15/
А по-моему β-меркаптоэтанол можна, у меня лизис буфер с β-меркаптоэтанол и белок выделяется и колонку использовал несколько раз лаж небыло еще, а вот ДТТ однозначно нельзя. Гость /08.05.2007 14:40/
А почему, что там происходит?? Дело в том, что хроматография на Ni-NTA прошла с ДТТ и все поделилось и почистилось, но только в процессе работы колонка из зеленовато голубой превратилась в бурокоричневую, но потом при отмывке имидазолом, эта бурая окраска сошла с белком и теперь препарат белка светлокоричневый. А колонка опять нормального цвета. Разница между βмэ и ДТТ только в дополнительных SH и ОН группах следовательно и реакция ионов никеля будет с ними одинаковой??? А как же работают на Ni-NTA с белками, которым нужны ДТТ и βмэ??? Tom1 /08.05.2007 15:42/
меняют ДТТ и мео на цистеин.... Esya /08.05.2007 16:03/
мео можно аж до 20 мМ - иногда размер, то есть число групп, важен ДТТ - хелатор, а МЭО - нет Еще можно TCEP - пользовать Это если никелевый сорбент пользовать, кобальтовый и МЕО плохо переносит по другим причинам. Читайте инструкцию. bio-1985 /05.09.2007 17:02/
Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали? Гость /09.01.2008 19:29/
"Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?" посмотрите на 23 стр этого протокола: Гость /09.01.2008 19:35/
"Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись?" EDTA 1mM EGTA 0.5mM 20% glycelol, можно до 50% glycerol (тогда колонку после нанесения элюирующего буфера лучше центрифугировать). guest: ммм /09.01.2008 22:43/
Дык есть коктейли из ингибиторов. Но ..., Что еще? Температуру пониже все делать на 0-4С, для хранения белок лиофилизовать хранить на -70 в двойной герметичной таре, в наружной таре держать активированный селикагель. watchesonline89 /22.12.2022 10:18/
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|