Главная страница MolBiol.ru > Методы > Кл. культуры > Основные приёмы работы Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Базовые методы


Ольга Смирнова
,
Лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транспорта, Институт биологии гена;
Алексей Солдатов,
Вадим Шаров.

    Снятие клеток с культуральных сосудов

  1. слить старую среду;
  2. 2-3 раза промыть клетки HBSS (без Ca2+, Mg2+) или раствором Версена (~3ml на 25 см2);
  3. залить монослой раствором для снятия клеток (чтобы полностью покрывал: ~1ml на 25 см2; но можно и больше, если не жалко);
  4. инкубировать при 370С, периодически аккуратно покачивая. Обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10' (время зависит от клеточной линии);
  5. когда клетки полностью отделятся от субстрата, добавить полной среды или PBS и тщательно диспергировать клетки;
  6. если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток: осадить центрифугированием ~200g, 5' и ресуспендировать в полной среде;
  7. считать и субкультивировать.


  8. Замораживание клеток

  9. только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде;
  10. просчитать количество живых клеток;
  11. осадить клетки, центрифугируя при 200-400g 5', удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок;
  12. ресуспендировать клетки в концентрации 1*107 - 5*107 клеток/мл в среде для замораживания с сывороткой или 0.5*107 - 1*107 клеток/мл в среде для замораживания без сыворотки;
  13. разлить в ампулы (2ml пробирки с завинчивающимися крышками) для замораживания. Охладить ампулы в ледяной бане 5' (или в холодильнике на +40С);
  14. клетки необходимо замораживать медленно - понижение температуры со скоростью ~10С в минуту (варианты в зависимости от богатства: (i) программируемый холодильник; (ii) специальный контейнер (от Gibco или Stratagene); (iii) пенопластовая коробка с толщиной стенок ~1см. Контейнер или коробка помещаются в морозильник на -700С - -900С ON);
  15. после замерзания ампулы переносят для хранения в жидкий азот.


  16. Размораживание клеток

    Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирование) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (ДМСО, глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полной среде.


    а. Метод с отмывкой от криоконсеванта

  17. клетки быстро оттаять при 370С на водяной бане;
  18. поместить 1-2ml клеток в ~25ml полной среды, очень аккуратно перемешать;
  19. центрифугировать клетки при ~80g 2-3' и удалить супернатант;
  20. аккуратно ресуспендировать клетки в полной среде и посчитать количество живых клеток;
  21. рассадить клетки. Количество живых клеток должно быть, по меньшей мере, 3*105 клеток/мл.

  22. Дополнение от Павла Гулак (ИБГ РАН):
    Если клетки очень чувствительны к ДМСО, то рзмораживать их можно до нулевой температуры (последние минуты - в руке, для удобства наблюдения за таянием льдышки вверху пробирки) и центрифугировать холодную взвесь клеток и даже в охлажденной центрифуге.

    б. Метод непосредственной посадки

  23. клетки быстро оттаять при 370С на водяной бане;
  24. посадить клетки в полной среде. Использовать 10-20ml среды на 1ml замороженных клеток. Необходимо сажать не менее 3*105 клеток/мл;
  25. растить клетки от 12 до 24 часов, затем заменить среду свежей чтобы удалить криоконсервант.


  26. Определение количества клеток

    Количество клеток в суспензии можно просчитать в камере Горяева. Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются.

    Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~40µl) смешивают с равным количеством 0.4% (w/v) раствора красителя в HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество "квадратов", в которых просчитываются клетки зависит от плотности клеточной культуры и от той точности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток).


    Камера Горяева. Технические данные.
    • Зазор 0.1mm
    • Сторона малого квадрата 0.05 ±0.001mm
    • Сторона большого квадрата 0.2 ±0.0015mm
    • Сторона сетки 3 ±0.005mm
    • Площадь сетки 9mm2.
    • Объем камеры 0.9mm3.
    Исходная концентрация клеток рассчитывается по следующей формуле:

    Для клеток неразведённой суспензии:
         С [cell/ml] = 2.5*105*(количество клеток в одном большом квадрате)
         С [cell/ml] = 4*106*(количество клеток в одном малом квадрате)
    Для клеток разведённой в два раза (красителем) суспензии:
         С [cell/ml] = 5*105*(количество клеток в одном большом квадрате)
         С [cell/ml] = 8*106*(количество клеток в одном малом квадрате)


    Транспортировка

    либо (более предпочтительно) в сухом льду, замороженными;

    либо при комнатной температуре: клетки выращивают до 60-80% монослоя, удаляют старую среду, культуральный флакон заливают полной средой доверху и плотно закручивают крышкой. При таком способе клетки можно сохранить живыми в течение 2 суток.

    NB! На наш взгляд, лучше предварительно "кондиционировать" новую среду в CO2-инкубаторе.



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 50682



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Растворы

    Все среды и растворы для эукариотических клеток готовятся на воде mQ или эквивалентного качества.

    PBS (рецепт 1) 10x

    pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4оС)
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO45.2mM52mM142g/M0.738g3.692g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O  mQ   
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO4x7H2O5.2mM52mM268.1g/M1.394g6.971g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O  mQ   

    PBS (рецепт 2) 10x

    pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4оС)
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.47mM14.7mM136.1g/M0.2g1.0g
    Na2HPO4x7H2O4.29mM42.9mM268.1g/M1.15g5.75g
    NaCl137mM1.37M58.44g/M8.0g40.0g
    KCl2.68mM26.8mM74.56g/M0.2g1.0g
    H2O  mQ   

    PBS (рецепт 3) 10x

    pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4оС)
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO42mM20mM136.1g/M0.272g1.36g
    Na2HPO4x7H2O10mM100mM268.1g/M2.68g13.41g
    NaCl137mM1.37M58.44g/M8.0g40.0g
    KCl2.7mM27mM74.56g/M0.20g1.01g
    H2O  mQ   
    • стерилизовать автоклавированием;
    • pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х;
    • pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.

    HBSS (Hanks' balanced salt solution) 10x

    Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
    pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4оС):
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO40.44mM4.4mM136.1g/M0.06g0.30g
    Na2HPO4x7H2O0.34mM3.4mM268.1g/M0.09g0.45g
    NaHCO34.2mM42mM84.01g/M0.35g1.75g
    NaCl137mM1.37M58.44g/M8.0g40.0g
    KCl5.4mM54mM74.56g/M0.40g2.0g
    CaCl21.3mM13mM110.98g/M0.14g0.70g
    MgCl2x6H2O0.5mM5mM203.30g/M0.10g0.50g
    MgSO4x7H2O0.41mM4.1mM246.48g/M0.10g0.50g
    D-glucose5.0mM50mM198.17g/M1.0g5.0g
    phenol red0.02%0.2%тв.0.2g1.0g
    H2O  mQ   
    • HBSS может быть без Ca2+ и Mg2+ (CMF-HBSS);
    • pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х, довести 1M HCl или 1M NaOH;
    • ёмкость с HBSS должна быть плотно закрыта, чтобы предотвратить потерю CO2 и защелачивание;

    Trypsin/EDTA раствор

    (хранить при -20оС не более года)
    Конц.Сток100ml500ml
    trypsin0.25% (w/v)тв.0.25g1.25g
    EDTA0.2% (w/v)тв.0.2g1.0g
    HBSS100ml500ml
    • вместо HBSS можно использовать 0.9% (w/v) NaCl;
    • можно готовить как 10х;
    • EDTA требуется для связывания Ca2+ и Mg2+, которые могут ингибировать действие трипсина;
    • для различных клеточных линий может использоваться различная концентрация трипсина.

    Сыворотка

    (хранить основной сток при -20 оС, рабочее количество (на месяц работы) - при +4оС);

    Плохо переносит замораживание-оттаивание, т.к. это вызывает денатурацию белков.

    Если требуется тепловая инактивация (для инактивации системы комплемента и предотвращения иммунологической реакции против культивируемых клеток) перед первым использованием расплавить и прогреть при 56оС 30' - 1h (вначале прогрева перемешать несколько раз). Подписать, что сыворотка heat inactivated (HI), оставить рабочее количество на +4оС, остальное разаликвотить, быстро заморозить (жидкий азот, сухой лёд) и хранить при -20оС.


    Раствор Версена

    (хранить сток при -20оС, рабочее количество при +4оС).

    Антибиотики

    (хранить при -20оС)

    Плохо переносят замораживание-оттаивание. Перед первым использованием расплавить, разаликвотить, по возможности быстро заморозить.


    Ростовые среды

    (хранить при +4оС).

    Обычно приготовление из сухих сред обходится гораздо дешевле, чем покупка готовых растворов.

    Полная (с сывороткой) среда готовится не более, чем на 1 месяц работы; не надо пытаться достигнуть "абсолютной точности" при добавлении сыворотки, той точности, которая обеспечивает градуированная банка, вполне достаточно.

    Разливать среду по матрасам можно "через" 50ml пробирку (и при разливе никогда не опираться о край "грязных" матрасов).



    Комментарии

    Общие

  • Данная методика сделана на основе (i) описания в Cell culture references. In Cell Culture. 1998-99 catalogue Life technologies, p. 9-(3-14); (ii) главы "Basic Techniques for Mammalian Cell Tissue Culture" из "Current Protocols in Cell Biology" и (iii) личного опыта авторов.
  • Здесь приведена общая схема работы с эукариотическими клетками. Оптимальные условия, времена и концентрации для каждой конкретной клеточной линии подбираются опытным путем. На сайтах клеточных коллекций (например, ATCC, DSMZ) можно получить индивидуальную информацию о конкретных линиях и условиях их культивирования.
  • Клеточные линии допускают сравнительно лёгкое замораживание/оттаивание. Это позволяет "вести" их только тогда, когда это действительно нужно. Нет никакого резона в том, чтобы поддерживать клеточную линию в термостате, а не в жидком азоте. Хранение криоконсервированных образцов позволяет избежать потери культуры в результате инфекционного заражения, уменьшить генетические изменения при непрерывном культивировании, избежать старения или окончательной дифференцировки клеток. Старайтесь работать так, чтобы свести количество пассажей к разумному минимуму. Схема работы с новой клеточной линией:
    "разгон" --> "замораживание/проверка" и "проведение экспериментов" --> "сворачивание работы"
  • Во избежание перекрестного загрязнения культур лучше не использовать одни и те же бутыли со средой и реагентами при работе с различными линиями клеток. Кроме того, пипетки, имевшие контакт с флаконами и бутылями с клетками, нельзя повторно использовать для отбора сред из соответствующих емкостей. Подробнее о правилах стерильной работы смотри в тексте "Стерильная работа". Кстати, по поводу антибиотиков: при аккуратной работе можно вполне без них обойтись.
  • Используемые среды и растворы перед добавлением к клеткам должны быть прогреты до температуры 370С (по крайней мере, до NT, но никак не "прямо из холодильника").
  • При пересеве следует отмечать на чашке (матрасе): дату, номер пассажа.
  • О культуральной посуде.
    Обычно культуральная посуда допускает многократное использование (особенно удобно и дёшево, если клетки позволяют растить себя в стеклянной посуде). Если культура одна и та же - просто пересеять на ту же чашку. В противном случае - мыть, стерилизовать ультрафиолетом.
    Сравнение культуральных флаконов (матрасов) и чашек Петри.
    Чашки ПетриМатрасы
    дешевледороже
    полный и удобный доступ к поверхностив зависимости от конструкции; иногда "мёртвые зоны"
    отличный газообменпробки матрасов должны быть закручены неплотно (если это не флаконы с вентилируемыми крышками)
    неудобно, что подписываются крышкинельзя путать неподписанные пробки
    к перевозке не приспособленыможно перевозить
    только CO2-инкубатор (хотя некоторые умельцы запаивают в полиэтиленовый пакет)для некоторых культур можно использовать простой термостат и плотно завинчивающиеся крышки
     чуть свободнее в обращении
  • В каталоге фирмы-изготовителя можно найти информацию о площади ростовой поверхности, общем объеме и рабочем объеме среды для культуральной посуды. Примерные объемы сред и растворов.
    Тип культуральной посудыОбъем ростовой средыОбъем PBS или р-ра Версена при отмывкахОбъем р-ра Версена или трипсин-Версена
    25см2 матрас 60mm чашка Петри5ml2-4ml1ml
    80mm чашка Петри (50см2)7-10ml3-5ml1.5-2ml
    75см2 матрас9-15ml3-5ml1ml

    По пунктам

    Снятие клеток с культуральных сосудов.
  • Выживаемость клеток в процессе культивирования должна составлять не менее 90%.
  • Клетки пересеваются при достижении ~90-100% монослоя (в конце логарифмической стадии роста). Можно чуть позже (клетки остаются живыми и через ~3 дня после формирования монослоя), но злоупотреблять этим не надо, так как чувствуют они себя при этом плохо и разгоняются потом медленно.
  • Оставить (NB! но это сильно зависит от конкретной культуры):
    ~1/3 для быстрого разгона,
    ~1/10 для "ведения" культуры,
    Доля рассева подбирается для того, чтобы установить удобное и регулярное расписание пересевов (раз или два раза в неделю).
  • п.1.

  • Всегда, когда речь идёт об удалении старой среды или отмывочного раствора, удобнее не выливать, а "отсасывать" с помощью насоса (можно водоструйного или слабого электрического) подключенного через ловушку.
  • п.4.

  • Точное время инкубации определяется визуально. Либо постучать о край матраса (или покачать его), чтобы увидеть, что большинство клеток стало отслаиваться, либо контролировать под микроскопом, что клетки округлились и отцепились от субстрата.
  • п.5.

  • Мы предпочитаем слегка прижимать пипетку ко дну при диспергировании клеток (более сильное дробление, меньше пены).
  • Тип культуры клетокРаствор для отмывкиРаствор для диссоциации
    * большинство постоянных клеточных линий;
    * клетки на ранних пассажах;
    * сильно прикрепляющиеся клетки
    HBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)0.25% (w/v) трипсин в сбалансированном солевом растворе без кальция и магния
    * постоянные клеточные линии;
    * в случае необходимости сохранить целостность белков клеточной поверхности
    HBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)0.05% (w/v) трипсин в 0.53mM EDTA
    * слабо прикрепляющиеся эпителиальные клетки;
    * трансформированные фибробласты;
    * первичные культуры, в случае необходимости сохранить целостность поверхностных белков
    HBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)EDTA, глицерин на цитрате натрия;0.04% (w/v) трипсин в 0.53mM EDTA, глицерине, цитрате натрия
    * крепко прикрепляющиеся клеточные линии на первых пассажахHBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)0.25% трипсин на 1mM EDTA
    0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS
    * эпителиальные клетки0.5 -1mM EDTA0.5-1mM EDTA
    0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS
    * крепко прикрепляющиеся клетки;
    * эпителиальные клетки;
    * некоторые опухолевые клетки
    0.5-1mM EDTA0.25% трипсин с 1 мМ EDTA
    0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS без кальция и магния
    Замораживание клеток
  • Клетки должны быть в логарифмической фазе роста (~70-90% монослой). Перед замораживанием клетки должны быть охарактеризованы и протестированы на наличие бактериального или иного заражения.
  • Лучше через некоторое время высеять одну пробирку, чтобы убедиться, что замораживание прошло нормально.
  • Для заморозки и последующего хранения клеток могут быть использованы среды различного состава.
    (а) Если клетки замораживаются не для роста, а для последующих биохимических исследований, то можно использовать PBS вместо среды с сывороткой.
    (б) На основе среды с сывороткой:
    полная среда плюс 10% глицерина,
    полная среда плюс 10% диметилсульфоксида (DMSO),
    50% кондиционированной среды плюс 50% свежей среды с 10% глицерином,
    50% кондиционированной среды плюс 50% свежей среды с 10% DMSO.
    (в) На основе среды без сыворотки:
    50% кондиционированной среды без сыворотки плюс 50% свежей среды без сыворотки с 7.5% DMSO,
    свежая среда без сыворотки, содержащая 7.5% DMSO и 10% раствор BSA (cell culture grade).
  • непроверенные данные Существует мнение, что клетки лучше замораживать без антибиотиков и не в ростовой среде, а прямо в сыворотке: 85-90% сыворотка и 15-10% DMSO. Причём эти авторы рекомендуют добавлять DMSO к охлаждённой до 0оС клеточной суспензии.
  • непроверенные данные В некоторых лабораториях клетки замораживают не медленно, а быстро: в жидком азоте. И всё нормально. Однако в этом случае, хорошо бы подержать клетки при 4-0оС хотя бы 15', чтобы дать криоконсерванту время проникнуть в клетки.
  • Глицерол, DMSO и медленное охлаждение предотвращают образование кристаллов льда, которые губят клетки.
  • п.11.

  • Требуется значительное время (~ON), чтобы охладить контейнер для замораживания до +4оС, поэтому лучше хранить его в холодильнике/холодной комнате.


  • Дополнения и комментарии людей знающих

    Вадим Шаров

    Как мыть культуральный пластик.

    Детергентом или хромпиком. Но после хромпика тщательно отмывать. Стерилизовать пластик только ультрофиолетом непрактично - желтеет и портиться, да и не слишком стерильно. Лучше 70% спиртом и чуть чуть на ультрофиолет (30 минут). А лучше (если есть) кобальтовой пушкой.


    Как чистить CO2 инкубатор при заростах.

    Все зависит от СО2 датчика.

    1. Можно медным купоросом или другим веществом с медью, затем вода и 70 % спирт (если датчик это выдерживает). Медный купорос на нержавейку не действует. Можно от купороса не отмывать. Выглядит не очень опрятно, но по опыту и клетки без антибиотиков растут и грибов нет. В поддон к воде добавляем бихромат калия - до желтизны. Воду не в поддон добавляем а в корытце или другую емкость.
    2. Формалином с детергентом.
    3. Азид натрия лучше не использовать. И себя отравишь и если подсушится - будет БАХ.

    Можно ли модифицировать поверхнось дешёвого пластика, чтобы использовать его для клеточных культур.

    Вообще полчаса в жестком хромпике и даже старые иммунологические платы связывают белки как новые, а клетки растут как звери. Только надо много раз полоскать после хромпика.


    Теперь о заморозке.

    Лучше чем замораживание в сыворотке (90%) DMSO (10%) не знаю. С фибробластами, даже первичными после такого замораживания не надо мучаться с откруткой от криопротектора.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    _Ella_ /11.01.2006 02:08/
    Довожу до сведения всех присутствующих, что ежели кто, желая снять эукариотические клетки с чашки Петри раствором Версена-трипсина, зальет их вместо этого содержимым стоящей рядом баночки с этанолом, пусть не беспокоится. Ничего страшного, не загнутся, спиртное в малых дозах полезно в любых количествах (спирт, правда, после запоздалого раскаяния лучше слить). Оно конечно не удивляет. Мы-то тоже вроде пока живы.



    Olena Bilyk /22.02.2006 23:06/
    Дорогие коллеги! Посоветуйте как заморозить клетки асцитической жидкости, взятые непосредственно у онкологических больных. Я первый раз с этим работаю, требуется совет.
    Лена



    Guest /22.02.2006 23:16/
    (Olena Bilyk @ 22.02.2006 22:06)
    Ссылка на исходное сообщение  Дорогие коллеги! Посоветуйте как заморозить клетки асцитической жидкости, взятые непосредственно у онкологических больных. Я первый раз с этим работаю, требуется совет.
    Лена



    Точно также, как и все остальные клетки морозят. Сходите на сайт celltransplant.ru - много спецов по этой тематике.



    Гость /23.02.2006 18:52/
    Уважаемые коллеги!

    Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
    Линия HaCaT(кератиноциты).

    Заранее огромное СПАСИБО



    гость: Ю /09.03.2006 18:15/
    (Гость @ 23.02.2006 17:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!

    Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
    Линия HaCaT(кератиноциты).

    Заранее огромное СПАСИБО




    Guest /09.03.2006 18:27/
    (Гость @ 23.02.2006 17:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!

    Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
    Линия HaCaT(кератиноциты).

    Заранее огромное СПАСИБО

    Можно использовать облучение ультрафилетом (минут 20), или митомицин С, 50 мкг/мл 1-2 час, или актиномицин Д (1-5 мкг/мл, колхицин и др клеточные яды и противоопухолевые химиопрепараты. А у меня к Вам вопрос как раздобыть клетки HaCaT? Уже давно ищу в бывшем СССР.
    Заранее спасибо.



    Гость /10.05.2006 17:59/
    Здравствуйте! Напишите ,пожалуйста,можно ли для снятия клеток NIH3T3 с чашки вместо трипсина использовать раствор Версена и как лучше это выполнить, чтобы получить максимально возможное количество клеток (надо для миграции)? заранее СПАСИБО.



    ммм /11.05.2006 12:07/
    ---Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
    Линия HaCaT(кератиноциты).

    НАГРЕТЬ ГРАДУСОВ ДО 50-60.

    поменять рН запредельно, или налить окислителя. а еще формалинчик тоже хорошо.



    bapik /12.09.2006 11:18/
    Всем привет! Коллеги помогите пожалуйста, как прокультивировать некоторое время опухоль вынутую из животного, а потом сделать перевивку уже на несколько животных. Извиняюсь за сумбурное изложение, в таких делах я просто чайник. Посоветуйте, что почитать.
    СПАСИБО.
    Андрей.



    Firefly76 /28.11.2006 20:01/
    Коллеги, посоветуйте, pls, что делать, если при культивировании клеток среда (DMEM/10%CBS) быстро защелачивается (приобретает фиолетовый оттенок. Клетки пойкилотермных животных, Т=26С, посуда NUNC. CO2 инкубатора нет, но введение газа в емкость не предотвращает этот процесс. ЗАРАНЕЕ БЛАГОДАРЕН.



    Ksiysha /30.11.2006 17:21/
    а клетки у вас там вообще делятся?



    Ksiysha /30.11.2006 17:26/
    (Гость @ 10.05.2006 17:59)
    Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте! Напишите ,пожалуйста,можно ли для снятия клеток NIH3T3 с чашки вместо трипсина использовать раствор Версена и как лучше это выполнить, чтобы получить максимально возможное количество клеток (надо для миграции)? заранее СПАСИБО.

    Можно и версеном, но подержать в инкубаторе придется подольше и снимать механически



    Гость /23.01.2007 17:50/
    Глубокоуважаемые коллеги!
    Посоветуйте простому генному механику...
    Задача - зафиксировать клетки на чашке, затем провести иммуноокрашивание рекомбинантного белка.
    Попробовали: фикс- 4%параформ на PBS+Tw20 0.01%, отмывка, иммуноокраш. с помощью Fab-фрагментов- POD, субстрат ТМБ.
    Получилось грязно, видна только внеклеточная локализауия белка.
    Кто-нибудь пробовал сапонин (? конц, время) для улучшения проникновения АТ в клетки?
    И какие субстраты лучше для такой работы (есть Fab'ы меченные АР) Спасибо
    кatia@ibch.ru



    guest: ммм /24.01.2007 12:20/
    ---зафиксировать клетки на чашке.
    Клетки то животные или бактериальные?
    Если животные то можно попробовать мягкую фиксацию типа метанол уксус или 80% ацетон при этом и доступ к внутренностям клеточным открывается.

    Получилось грязно, видна только внеклеточная локализауия белка.
    Может это неспецифика? Клетки-то наверное можно отмыть как-то от внеклеточного белка перед фиксацией.

    --есть Fab'ы меченные АР
    Для такой хрени используют бром -хлор-индолил фосфат с нитросиним тетразолиевым в паре. Ну и буфер щелочной для субстрата.



    curious67 /18.02.2007 16:24/
    2 guest: ммм
    Спасибо за ответ!
    Пробовала 80% ацетон и 4%парафрорм на PBS
    С ацетоном лучше, для параформа требуется обработка сапонином (чтобы мембраны разрушились и АТ проникли внутрь).
    А насчет отмывки - это не грязь и не неспецифика, белок имеет внутри- и внеклеточную локализацию (что видно на флуор. микроскопе, поскольку мы имеем дело с аналогом GFP).
    А субстрат у меня ТМБ.
    Он выцветает при хранении. Попробую этот ваш бром-хлор...
    Спасибо за Ваши комментарии!!!



    Guest /18.02.2007 17:04/
    (curious67 @ 18.02.2007 15:24)
    Ссылка на исходное сообщение  2 guest: ммм
    Пробовала 80% ацетон и 4%парафрорм на PBS


    curious67, Вы что, пол сменили? confused.gif



    curious67 /18.02.2007 19:04/
    быстрая реакция! Спасибо за внимание к моей персоне Это другой пользователь, который не спросясь зашел, но не в курсе несколько, как логиниться и тп. Потому как не имеет времени переливать из пустого в порожнее, как мы с Вами. Попробую убедить завести себе ник. Пока не обижайте уж



    pchelinka /19.02.2007 09:44/
    [Всем привет! Коллеги помогите пожалуйста, как прокультивировать некоторое время опухоль вынутую из животного, а потом сделать перевивку уже на несколько животных. Извиняюсь за сумбурное изложение, в таких делах я просто чайник. Посоветуйте, что почитать.
    СПАСИБО.
    Андрей.quote]


    мы перевивали мышей сразу (не культивируя дополнительно) - вынутую из мышки опухоль, (асцитная или солидная), переносилась в буфер Хенкса, или в RPMI, объем которых должен быть небольшой - 1-2 ml и температуры чел тела (капля раствора на тыльной стороне руки не чувствуется). Далее концентрация клеток в растворе разводилась до 10*6 (степ) в ml и по 400-500 мкл вводилась в животное уколом в брюхо - для брюшного асцита. Для других опухолевых клеток перевиваемая концентрация может быть другая.



    Гость /17.04.2007 10:26/
    Дорогие коллеги,

    Чем принципиально отличается работа с культурами клеток насекомых, например, от культур гибридом?
    Мне скоро предстоит работать с первыми и хочется быть немножечко "в танке".....
    Спасибо.....



    kolya1984 /26.10.2007 13:10/
    Помогите пожалуйста. Кто знает что - нибудь про культивирование нервной ткани расскажите методику и материалы.



    Bogatick /07.11.2007 19:05/
    Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?



    guest: ммм /07.11.2007 20:49/
    ---Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?

    Грубо! - Между субстратом и рецепторами адгезии образуются кальциевые мостики.

    типа СОО- +Са+ -ООС.



    Bogatick /08.11.2007 19:08/
    ммм, спасибо



    Гость /12.11.2007 20:00/
    можно ли заменить со2 инкубатор обычным термостатом при приготовлении препаратов хромосом клеток костного мозга для fish-диагностики и цитогенетического исследования.



    guest: ммм /12.11.2007 20:29/
    Можно попробовать два варианта первый использоавать среду с HEPES буфером
    второй ставить чашку в эксикаторе в котором погасла горящая свеча(от недостатка кислорода). Гарантий никаких при любом из способов, хотя первый предпочтителней.



    Гость /16.11.2007 14:21/
    Bogatick /07.11.2007 19:05/
    Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?

    кадгерины кальций-зависимы



    Гость /16.11.2007 14:21/
    Bogatick /07.11.2007 19:05/
    Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?

    кадгерины кальций-зависимы



    Гость /19.11.2007 12:32/
    подскажите кто нибуть самый простой и ефективный метод приготовленния Brhadyrizobium japonicum для проведения фореза



    polymerase /23.01.2008 23:19/
    Объясните, пожалуйста.
    Трансфекция эу-клеток.
    Почему, когда мы проводим трансфекцию одновременно двумя плазмидами, считается, что во все клетки попадают обе? Пусть создается смесь трансфекционного реагента и двух плазмид, а затем раскапывается на клетки. Тогда, теоретически, у нас будет 4 вида комплексов: агент, не захвативший ничего, агент захвативший плазмиду1, плазмиду2 и обе. И, если в плазмиды включена кднк GFP, то визуально ну ни как отличишь эти комплексы ( ну то есть светится клеточка, а какая?)! Я в тупике.



    Нора /05.06.2008 16:24/
    mol.gif Здравствуйте, коллеги! Подскажите, пожалуйста, при получении первичных кератиноцитов каким образом помещают биоптат в раствор диспаза? И каким образом наносить коллаген на культуральный пластик, в чем его предварительно растворить и чем дополнить?
    Огромное спасибо!



    myosotica Гость /19.09.2008 13:33/
    Здравствуйте коллеги!
    Подскажите пожалуйста где можно найти протокол получения подкожных человеческих фибробластов? Очень нужно :mol:



    chatter /19.09.2008 17:43/
    (Гость @ 23.02.2006 18:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!

    Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
    Линия HaCaT(кератиноциты).

    Заранее огромное СПАСИБО

    Хромпиком.



    chatter /19.09.2008 17:53/
    (polymerase @ 23.01.2008 23:19)
    Ссылка на исходное сообщение  Объясните, пожалуйста.
    Трансфекция эу-клеток.
    Почему, когда мы проводим трансфекцию одновременно двумя плазмидами, считается, что во все клетки попадают обе? Пусть создается смесь трансфекционного  реагента и двух плазмид, а затем раскапывается на клетки. Тогда, теоретически, у нас будет 4 вида комплексов: агент, не захвативший ничего, агент захвативший плазмиду1, плазмиду2 и обе. И, если в плазмиды включена кднк GFP, то визуально ну ни как отличишь эти комплексы ( ну то есть светится клеточка, а какая?)! Я в тупике.

    Один липофектаминовый комплекс включает в себя много-много плазмид. При эквимолярном соотношении векторов в смеси довольно сложно себе представить, как липофектамин матерясь ползает по пробирке, собирая исключительно GFP-вектора лишь бы вам нагадить. smile.gif



    Гость /09.02.2009 18:19/
    Коллеги, есть серьезные подозрения, что фетальная сыворотка Hyclon заражена микоплазмой. После фильтрации предварительно вылеченные клетки вроде не приобретают микоплазму (по тесту с DAPI). Есть ли у кого-нибудь опыт очитки сыворотки (а е клеток) от микоплазмы? Сами клетки прекрано лечатся Mycoplasma Removing Agent производства ICN. Но с сывороткой непонятно что делать. Главное, много ее накупил.



    Гость /27.02.2009 14:10/
    это не чиститься, насколько мне известно, просто обращаетесь к производителю и они ОБЯЗАННЫ поменять вам сыворотку на нормальную



    Guest /27.02.2009 20:36/
    (Firefly76 @ 28.11.2006 19:01)
    Ссылка на исходное сообщение  Коллеги, посоветуйте, pls, что делать, если при культивировании клеток среда (DMEM/10%CBS) быстро защелачивается (приобретает фиолетовый оттенок. Клетки пойкилотермных животных, Т=26С, посуда NUNC. CO2 инкубатора нет, но введение газа в емкость не предотвращает этот процесс. ЗАРАНЕЕ БЛАГОДАРЕН.



    1. Если добавляете НЕРЕS, не добавлять.
    2. Увеличить на порядок концентрацию клеток (если не слишком большая)
    3. Увеличить концентрацию фетальной сыворотки (смело можно до 20%)
    4. В свое время, когда у нас не было СО2 инкубатора , мы добавляли СО2 в эксикатор с помощью бытового сифона и балончиков с СО2 для сифонов (сейчас их продают для пистолетов), но добавляли каждые 6 часов и крышку эксикатора смазывали глицерином.
    5. каждые 4 -6 часов менят среду культивирования на новую
    Успехов



    Гость /28.02.2009 02:31/
    Коллеги помогите!!! Для отработки методики нужны эпителиальные клетки кишечника человека. Конечно хотелось бы нормальных не раковых клеток, но вряд ли существуют такие клеточные линии. Подскажите пожалуйста какую использовать клеточную линию которая максимально сохранила свойства эпителия кишечника человека.



    katya-akts /16.03.2009 15:32/
    Вопрос к Гостю, писавшему про сыворотку HyClone и микоплазму:
    не могли бы Вы уточнить номер партии сыворотки, на которую такие подозрения?

    моя почта katya_akts{sobaka}mail.ru



    galina.glousker /22.03.2009 14:47/
    Уважаемые коллеги, нужен совет: культура неиммортализованных человеческих фибробластов ночь простояла в пониженной концентрации углекислого газа - кто-то умный перекрыл вентель на баллоне. Клетки вроде живы, но мы работаем с ДНК - кто-нибудь знает, насколько серьезны могут быть повреждения у выживших клеток и как это проверить? Заранее спасибо



    Гость /27.03.2009 11:00/
    Добрый день!
    Подскажите, пожалуйста!
    Я хочу выделить белок из эндотелиальных микрочастиц плазмы крови - как можно разрушить мембрану, но так, чтобы не денатурировал белок? - Может быть, ультразвуком, но в течение какого времени?



    Гость /02.04.2009 14:36/
    Здравствуйте, подскажите , пожалуйста, как фиксировать клетки млекопитающих, чтобы посмотреть внутриклеточную локализацию рекомбинантного белка с GFP?



    alsan /25.10.2014 20:52/
    Подскажите пожалуйста, как организовать работу с суспензионными культурами клеток. В каких колбах качать, какие крышки можно использовать? Или только Corning PC c вент крышкой?



    MMM /26.10.2014 08:23/
    (alsan @ 25.10.2014 21:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста, как организовать работу с суспензионными культурами клеток. В каких колбах качать, какие крышки можно использовать? Или только Corning PC c вент крышкой?

    Если вы не собираетесь растить их мегалитрами, то подходит ЛЮБАЯ культуральная посуда для адегизионных культур. Так же можно использовать ПС чашки для бактерий. Качать в колбах низя. Они не бактерии потоки жидкости не любят. Их если в масштабах литров растят, то при ооочень медленном перемешивании в лабах обычно с помощью ролерной технологии, а в производстве в спец ферментерах.



    alsan /26.10.2014 16:37/
    Т.е. суспензию без перешивания? В CO2? Или можно и с резиновой крышкой?



    guest: ммм /26.10.2014 18:07/
    В СО2 конечно, бЕз СО2 можно, но на спец среде и не всякую суспензию. При большом объеме - сотни мли более - либо нужно много мелкой посуды, либо все таки перемешивание нужно но мееедленное типа один цикл в 5-10 минут, можно еще медленнее.



    Dr. Lektor /03.08.2016 13:21/
    Уважаемые коллеги. Подскажите пожалуйста как получить чистую линию макрофагов человека из венозной крови, как их содержать и какова их жизнеспособность?
    Заранее благодарен.



    CowDoc /20.09.2016 19:07/
    (MMM @ 26.10.2014 08:23)
    Ссылка на исходное сообщение  Качать в колбах низя. Они не бактерии потоки жидкости не любят. Их если в масштабах литров растят, то при ооочень медленном перемешивании в лабах обычно с помощью ролерной технологии, а в производстве в спец ферментерах.

    Не слушайте! Все зависит от вида клеток и среды. И опыта. Посмотрел бы я на вас, как бы вы [/b]очень медленно перемешивая выращивали бы простейшие BHK-21








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler