Главная страница MolBiol.ru > Методы > Иммуногисто.. > Белок на срезах взрослых мух Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила)

Елена Набирочкина
Институт Биологии Гена РАН


    Приготовление препаратов

  1. приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
  2. сушить в термостате 37oС, ON.


  3. Иммуноокрашивание

  4. депарафинировать в гистологических стаканах:
  5. ксилол (I) => 5'
    ксилол (II) => 5'
    ксилол:EtOH (100%) (1:1) => 2'
    EtOH (100%) (I) => 1'
    EtOH (100%) (II) => 1'
    EtOH (96%) => 1'
    EtOH (70%) (I) => 1'
    EtOH (70%) (II) => 1'
    H2O (mQ) => 1';

  6. накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2';
  7. инкубировать 2х 5' в TBS в 100ml стеклоприемнике;
  8. 15' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
  9. приготовить разведение первичных антител в TBSTB из расчета 100-150µl на стекло;
  10. убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов (осторожно!) и нанести разведенные первичные антитела (~100-150µl на стекло);
  11. инкубировать при NT 2h во влажной камере;
  12. отмыть 2х10' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
  13. приготовить разведения вторичных антител из расчета 100-150µl на стекло.;
  14. убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов, нанести разведенные вторичные антитела, ассоциированные с пероксидазой;
  15. инкубировать при NT 1h во влажной камере;
  16. отмыть 2х5' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике.


  17. Окрашивание DAB

  18. растворить комплект из двух таблеток "Fast DAB" в 5ml H2O, очистить: либо ЦФ NT, 5', либо фильтровать через 0.45µm фильтр;
  19. нанести на каждое стекло ~200µl раствора Fast DAB;
  20. следить за ходом реакции, сравнивая с контрольным препаратом (без первичных антител);
  21. когда реакция достигнет насыщения, остановить, сполоснув в TBSTB.


  22. Заключение в Tris-glycerol mountant

  23. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
  24. накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
  25. осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
  26. подсушить 5-10’ NT;
  27. аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
  28. препараты хранить при NT в темноте.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9735

    Растворы

    TBS

    10x (хранить при +4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10ml
    NaCl1.5M5M30ml
    H2O mQ60ml

    Tris-glycerol mountant

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml
    glycerol90%100%9.0ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml

    TBSTB

    (свежеприготовленный)

    Конц.Сток100ml
    TBS1x10x10.0ml
    сыворотка10%100%10.0ml
    Tween 200.1%10%1.0ml
    H2O mQ79ml


    Комментарии

    По пунктам

    п. 1.

  • Срезы прикрепляются к предметному стеклу, обработанному polyL-lysine или TESPA "Обработка стекол.".
  • п. 6.

  • Предокрашивание. Сыворотка из TBSTB предотвращает неспецифическое связывание первичных антител.
  • п. 8.

  • Жидкость вокруг срезов убирают для того, чтобы не растекался раствор антител.
  • п. 15.

  • Кит: Sigma, #D0426, "Fast DAB with metal enhancer".
  • п. 20.

  • Если пузыри всё же попали, то не надо пытаться их выдавить - поплывут и порвутся срезы, препарат испортится.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler