Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила)
Приготовление препаратов
- приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
- сушить в термостате 37oС, ON.
Иммуноокрашивание
- депарафинировать в гистологических стаканах:
ксилол (I) => 5'
ксилол (II) => 5'
ксилол:EtOH (100%) (1:1) => 2'
EtOH (100%) (I) => 1'
EtOH (100%) (II) => 1'
EtOH (96%) => 1'
EtOH (70%) (I) => 1'
EtOH (70%) (II) => 1'
H2O (mQ) => 1';
- накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2';
- инкубировать 2х 5' в TBS в 100ml стеклоприемнике;
- 15' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
- приготовить разведение первичных антител в TBSTB из расчета 100-150µl на стекло;
- убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов (осторожно!) и нанести разведенные первичные антитела (~100-150µl на стекло);
- инкубировать при NT 2h во влажной камере;
- отмыть 2х10' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
- приготовить разведения вторичных антител из расчета 100-150µl на стекло.;
- убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов, нанести разведенные вторичные антитела, ассоциированные с пероксидазой;
- инкубировать при NT 1h во влажной камере;
- отмыть 2х5' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике.
Окрашивание DAB
- растворить комплект из двух таблеток "Fast DAB" в 5ml H2O, очистить: либо ЦФ NT, 5', либо фильтровать через 0.45µm фильтр;
- нанести на каждое стекло ~200µl раствора Fast DAB;
- следить за ходом реакции, сравнивая с контрольным препаратом (без первичных антител);
- когда реакция достигнет насыщения, остановить, сполоснув в TBSTB.
Заключение в Tris-glycerol mountant
- ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
- накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
- осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
- подсушить 5-10’ NT;
- аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
- препараты хранить при NT в темноте.
Комментарии
По пунктам
п. 1.
- Срезы прикрепляются к предметному стеклу, обработанному polyL-lysine или TESPA "Обработка стекол.".
п. 6.
- Предокрашивание. Сыворотка из TBSTB предотвращает неспецифическое связывание первичных антител.
п. 8.
- Жидкость вокруг срезов убирают для того, чтобы не растекался раствор антител.
п. 15.
- Кит: Sigma, #D0426, "Fast DAB with metal enhancer".
п. 20.
- Если пузыри всё же попали, то не надо пытаться их выдавить - поплывут и порвутся срезы, препарат испортится.
|
Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
|
MolBiol.ru >
Методы >
Иммуногисто.. > Белок на срезах взрослых мух
Zbio-wiki
Дополнить