Главная страница MolBiol.ru > Методы > Макро-методы > Spotting (AMAZON) Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Перенос PCR продуктов на мембрану - spotting (Amazon)

 

    Заранее

  1. занять робот на те дни, когда вы собираетесь проводить споттинг;
  2. убедиться, что имеется достаточно мембран, Gel-blotting-papier GB004, 20хSSC, 10M NaOH, 30%EtOH, 96%EtOH, нарезать Whatman 3MM по размеру мембран;
  3. перенести PCR продукты из PCR-плашек в PC-плашки со щелочью (хранить несколько дней в холодной комнате);


  4. Подготовка робота

  5. включить компьютер (с клавиатуры) "MPI Spotting robot LabVIEW", Matthias/spot;
  6. включить главный выключатель (зеленая кнопка в левой нижней части);
  7. включить "Linear drivers" (черный переключатель левее и ниже);
  8. подождать пока установятся драйверы ~ 10';
  9. если Вы не предыдущий пользователь робота, проведите тестирование установок робота:
  10. * вставить gadget и поместить в stack несколько пустых плашек;
    * выбрать из главного меню "Configure hardware";
    * из Maintenance menu выбрать "Function run page";
    * проверить, что при работе с плашками не возникает никаких проблем: "Take plate" и затем "Put plate" в различные позиции stack ("plate number");
    * оставить последнюю плашку в держателе, вернуться (выбрав "ОК") в Maintenance menu;
    * выбрать "Hardware config. Page";
    * выбрать №3 в маленьком окне рядом с красным окном "Config. array";
    * нажать "Kill" (отключается управление роботом) и аккуратно переместить робот так, чтобы иглы gadget оказались точно в центре и дна microtiter plate.
    * сравнить значение "Z-position" co значением в окне "Misc. 1"; реальное значение должно быть на 1 mm больше установленного (Внимание!!! Все расстояния указаны в микронах!)
    * положить по одному листу Schleicher&Schuell GB004 и на позицию "filter 3". переместить робот так, чтобы иглы gadget едва касались Watman 3MM;
    * выбрать №9 в маленьком окне;
    * сравнить значение "Z-position" co значением в окне; реальное значение должно быть на 1-2 mm больше установленного (Внимание!!! Все расстояния указаны в микронах!);
    * в случае несовпадения нужно проконсультироваться с инженером.


    Калибровка положения фильтров

  11. оргстеклянные блоки вымыть и высушить;
  12. подписать те, которые предполагается использовать; уложить GB004, 3MM и писчую бумагу (вместо мембран);
  13. провести ink-test spotting (gap = 1000µm) 1x перенос по угловым полям фильтров;
  14. отметить на оргстеклянных блоках требуемое положение фильтров;
  15. можно проводить реальный споттинг.


  16. Перенос

  17. менять 30% EtOH в щетке через каждую вторую плашку;
  18. по нашему мнению полтора цикла отмывки на щётке недостаточно для хорошей отмывки игл, поэтому мы дополнительно перед каждой чашкой промакиваем иглы мягким поролоном (вручную в перчатках).


  19. После переноса

  20. зафиксировать DNA на мембране UV =120mJ/cm2
  21. подписать фильтры (название мембраны, поле, лот) немываемыми чернилами (Faber-Castell TG1, #16 33 99), разрезать;
  22. хранить при NT или –20oС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 7980




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Робот можно остановить открыв переднее стекло.
  • При запуске/перезапуске работа gadget-держатель нужно поместить в ~30 cm от "Home position" ("Home position" - левый верхний дальний угол робота.
  • Воздушный вентиль - нижний передний угол левого края робота. Следует использовать, если при остановке робот зажал плашку.
  • Градиент плотности споттинга в пределах поля по вертикали или горизонтали означает проблемы с установкой положения gadget при обмакивании в плашку. Проблема может быть решена поправкой ~в 0.1 mm (как это можно объяснить логически я не знаю).
  • Плашки следует помещать в робот понемногу (2 плашки перед той, которая в данный момент в работе), иначе они подсохнут по краям за время споттинга. Остальное время плашки должны находиться в холодной комнате.
  • Чтобы иметь представление о необходимом для spotting времени: на "Amazon" для 10-кратного переноса одной плашки на 6х6 полей требуется ~27 минут.
  • По поводу порядка, в котором робот разносит PCR-смесь по мембранам смотри комментарий к п. 11 в "Перенос PCR продуктов на мембрану – spotting (QBOT).".
  • Есть два альтернативных варианта проведения spotting:
  • * из PCR смеси на влажные (в 0.4M NaOH) мембраны,
    * на сухие мембраны из PCR смеси к которой добавлен NaOH до 0.5M.

    Оба способа имеют как преимущества, так и недостатки.
    При переносе на влажные фильтры:

    1. пятна получаются заметно большего размера, чем при переносе на сухие (не рекомендуется плотности выше, чем 4х4),
    2. при spotting большого количества плашек мембраны могут подсыхать, равномерность подсыхания на разных мембранах практически не контролируется;

    При переносе на сухие фильтры:

    1. требуется дополнительная операция - добавление к PCR-смеси NaOH,
    2. говорят, что присутствие щелочи портит PCR-продукты (возможно, что это зависит от присутствия бетаина), поэтому принято после её добавления быстро (в течение ~недели отспотить все фильтры);

    Мы считаем, что преимущества споттинга на сухие фильтры сильно перевешивают его недостатки.

  • Установочные значения для нашего споттинга:
  • Dryer position
    X413555 Directly above dryer
    Y747765
    Z172500
    MISC1119000Retreat position
    MISC25000Time in dryer
    Home
    X50000 
    Y50000 
    Z50000 
    Ink position
    X1127890 Above the plate
    Y769325
    Z100000
    MISC1134300Dip Z pozition
    MISC2100(ms) in plate
    Plate stack
    X1174500 Plate 1 position
    Y538900
    Z-5800
    MISC11033515Offset when grabber has released plate in plate stack (careful setup!)
    MISC21500 
    Plate holder position
    X916475 Plate held in plate holder
    Y731200
    Z171600
    MISC1810000X-moving into plate holder
    MISC2141680Z-when taken out
    Stamp position
    Z175680 
    MISC1100(ms) stamp time
    Filter 3 position
    X1056545 Botttom left corner
    Y641465
    Filter data
    X220000 
    Y220000 

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler