Главная страница MolBiol.ru > Методы > Nest. deletions > С помощью Exo III/MB nuclease Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Получение серийных делеций с помощью Exo III/MB nuclease

 
    Схема линеаризации плазмиды
  1. почистить pDNA CsCl или другим методом так, чтобы в результате суперскрученная DNA составляла >90%;
  2. (optional)
  3. проверить используемые рестриктазы на отсутствие ник-активности;

  4. резать pDNA двумя рестриктазами (рестриктазой, дающей 3'-выступающий конец со стороны вектора и рестриктазой, дающей 5'-выступающий или тупой конец со стороны вставки),
  5. проверить полноту рестрикции на форезе;
  6. Ф:Х, Х, переосадить;
  7. для каждой контрольной точки приготовить смесь из 0.8µl 10x MB.buffer + 6.2µl H2O;
  8. приготовить общую "Exo III смесь" из расчёта на каждую контрольную точку:
  9. резанная pDNA 0.2µg,
    2x Exo III buffer 0.5µl,
    свежий 100mM bMeEtOH 0.1µl,
    Exo III 20u/pmol концов*,
    H2O до суммарного объёма 1µl;

    * 0.2µg 3kb фрагмента => ~0.1pmol одного конца, т.е. 2u Exo III на точку (пересчёт веса в моли для ДНК на странице "Нуклеотиды, нуклеиновые кислоты");

  10. инкубировать на подходящей температуре;
  11. переносить 1µl аликвоты в пробирки из п.6 через равные промежутки времени, пробирки -> в жидкий азот;
  12. когда все аликвоты отобраны: 68oС, 15', затем в лёд;
  13. к каждой пробирке + 0.6u MB.nucl. (разведённой в 1х MB. dilut buffer);
  14. 30oС, 30';
  15. + 10х буфер внесения (остановить реакции), на форез;
  16. выделить фрагменты в PEG/TAE;
  17. самолигирование (NT, ~2h);
  18. трансформация;
  19. анализ клонов с помощью PCR;
  20. подходящие по размеру клоны -> на выделение одноцепочечной DNA.


  21. Заполнение 5'-выступающих концов тиопроизводными

  22. разрезать плазмиду рестриктазой, дающей 5'-выступающий конец (10-20µg в 500µl);
  23. 75oС, 15';
  24. + 2µl 1mM стока thio-dNTP,
  25. + 5u Klenow pol.;
  26. NT, 10';
  27. Ф:Х, Х, осадить EtOH;
  28. проверить эффективность защиты расщеплением аликвоты ExoIII нуклеазой;
  29. провести вторую рестрикцию.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 8307

    Растворы

    2х ExoIII буфер

    (хранить при -20o):

    Конц.Сток1ml
    Tris Cl, pH8.0100mM1M100 µl
    MgCl210mM1M10 µl
    tRNA20µg/ml10 µg/ µl2 µl
    H2O mQ888 µl

    1x Mung Bean dilution буфер

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток1ml
    AcONa, pH5.010mM3M3.3 µl
    AcOZn0.1mM100mM1 µl
    Cysteine1.0mM100mM10 µl
    Triton X-1000.1%10%10 µl
    глицерин50%100%0.5ml
    0.63g

    H2O mQ476 µl

    10x Mung Bean reaction буфер

    (хранить при -20o):

    Конц.Сток1ml
    AcONa, pH5.0300mM3M100 µl
    NaCl500mM5M100 µl
    ZnCl210mM1M10 µl
    H2O mQ790 µl



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Схема получения серийных делеций:
  • а) молекула pDNA линеаризуется таким образом, что векторный конец оказывается защищённым от действия ExoIII (либо 4х членным 3'-выступающим концом, либо заполненным тионуклеотидами 5'-выступающим), а конец вставки - нет.

    Схема реакции

    г) самолигирование, трансформация.

  • ExoIII обладает непроцессивной 3'-нуклеазной активностью (фермент покидает субстрат после отщепления одного нуклеотида). Это гарантирует, что вся предоставленная двухцепочечная DNA будет превращаться в одноцепочечную в приблизительно равном темпе.
  • Подобрать с первого раза режим расщепления ExoIII непросто. Обычно это удается лишь в случае, когда нужно обработать целую серию матриц. Первый эксперимент (для первой матрицы) будет, вероятно, неудачным, поэтому надо уменьшить число промежуточных точек и рассматривать его как прикидочный.


  • По пунктам

    п. 1.

  • Иначе ExoIII будет начинать расщепление начиная не только с конца вставки, но и с одноцепочечных разрывов.
  • п. 2.

  • Для проверки рестриктаз удобно использовать вектор, из которого был вырезан multiple cloning сайт.
  • п. 5.

  • Очистка от рестриктаз.
  • п. 8.

  • Промежутки времени выбираются так, чтобы изменение длины pDNA было ~1/2 от той длины, которая уверенно читается на сиквенсовом геле.
  • длина участка, переводимого в одноцепочечную форму за 1 минуту Exo III (20u/1pmol DNA концов):
  • 37oС~290-400
    34oС~270-370
    30oС~170-230
    23oС~90-130

    п. 9.

  • Активность ExoIII сильно подавляется кислым буфером для Mung Bean нуклеазы.
  • п. 10.

  • Тепловая инактивация ExoIII.
  • п. 13.

  • Электрофорез служит как для выделения молекул нужного размера, так и для очистки DNA от Mung Bean нуклеазы и её буфера.
  • п. 17.

  • В качестве праймеров используются праймеры из вектора, фланкирующие полилинкер. С помощью PCR контролируются:
    1. размер вставки,
    2. сохранность участка вектора, с которого будет проводиться сиквенс (иногда подъедается и векторный конец).

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler