Главная страница MolBiol.ru > Расчёты > Вычисления > Параметры PCR реакции Rambler's Top100  English version
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Расчёт параметров PCR

Форма помогает оценить сбалансированность PCR реакции и необходимое число циклов. Оценка довольно примитивная, так что полностью на неё полагаться опасно.

         Параметры:







    длина PCR продукта:   kbp 
    концентрация каждого из dNTP's:   mM  
    количество каждого из праймеров:   pmol
    количество Taq полимеразы:   u   
    объём реакции:   µl  
    время элонгации:   min :  sek
     

    вес геномной ДНК:    
    или
    вес матрицы:     
    или
    количество матрицы:        или     
         Результаты:

       Соотношение нуклеотидов и праймеров:
            израсходуется %

       Максимально возможный выход:    
            концентрация:      или  

       Полимераза способна синтезировать за один цикл:      ДНК;
            концентрация:      или  

       Максимально допустимая длина продукта (из расчёта 2kbp/min)  kbp

       При идеальном удвоении для завершения реакции потребовалось
            бы циклов. Однако, экспоненциальная амплификация
            может идти не более, чем циклов из за ограничения
            по активности полимеразы (дальше - только линейная).

    Параметры по умолчанию соответствуют амплификации 2kbp фрагмента из 0.5µg человеческой DNA. Предполагается, что:

    • условия реакции близки к нормальным, так что не приходится беспокоиться о самой возможности проведения PCR (слишком высокая концентрация полимеразы чревата амплификацией грязи, слишком много праймеров - образованием праймер-димеров);
    • A, T и G, C входят в PCR продукт поровну;
    • праймеры не образуют праймер-димеров;
    • Taq полимераза не теряет активность в ходе реакции.


    Оценка проводится следующим образом. Обозначим:

    • длина PCR продукта = L [kbp];
    • концентрация каждого из dNTP's = с [mM];
    • количество каждого из праймеров = q [pmol];
    • количество Taq полимеразы = a [u];
    • объём реакции = V [µl];
    • время элонгации = t [min];

    • количество матрицы = mo;

    Тогда:

    1. количество синтезированного PCR продукта можно оценить, как минимум из двух:
      количество при полном расходе нуклеотидов:
           mn = 4[нуклеотида] x с[mmol/l] 324.5[g/mol] x V[µl] = 1300сV [ng]
      количество при полном расходе праймеров:
           mp = q[pmol] x 2[цепи] 324.5[g/mol] x L[kbp] = 650qL [ng]
    2. максимальное количество PCR продукта, которое может быть синтезировано за один цикл, зависит от двух факторов:
      1. скорости движения Taq полимеразы по матрице: 2-4[kbp/min];
      2. активности полимеразы (1 u активности - количество фермента, которое включает 10nmol всех четырёх dNTP’s за 30 min при 72oC).
           mcycle = 10[nmol] x 324.5[g/mol] x a [u] t[min] / 30[min] = 108at [ng]
    3. количество циклов, которое требуется для синтеза "mmax" PCR-продукта:
           mmax = 2n x mo     =>     n = ln(mmax/mo)/ln2
    4. связь молярных и весовых количеств:
           m[µg] = 649[g/mol] x q[µmol] x L[kbp] x 1000


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 25450

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler